Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздравмедпрома РФ N 101, Госкомсанэпиднадзора РФ N 46 от 19.04.95 "О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ ОТ ГРИППА И ДРУГИХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"

Использование иммуноферментного метода индикации антител к возбудителям острых респираторных вирусных инфекций обеспечивает ряд преимуществ перед традиционными тестами.

К ним относятся:

- высокая чувствительность тестов (титры выявляемых антител в сотни раз превышают регистрируемые в РТГА и РСК);

- специфичность анализа (на результат реакции не влияет присутствие неспецифических ингибиторов сывороток);

- повышенная (на 10-40%) частота распознавания вирусных ОРЗ при гриппе А, аденовирусной и РС-вирусной инфекциях;

- возможность дифференцированной индикации специфических антител классов IgG и IgM и распознавании тем самым острой фазы заболеваний, например, при внутрибольничных инфекциях, при вспышках ОРЗ и др.;

- возможность использования микроколичества сыворотки (1 мкл) для проведения анализа;

- отсутствие необходимости в трудоемких операциях по титрованию антител (при количественной индикации результатов реакции на мультискане).

Для проведения иммуноферментного анализа используют тест-системы, разработанные и выпускаемые НИИ гриппа РАМН.

Состав набора:

Приготовление растворов

1. ФСБ

Для получения 0,5 л ФСБ содержимое флакона N 9 растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

2. Промывающий раствор (ПР)

Для получения ПР к 500 мл ФСБ добавляют 0,25 мл твина-20.

3. Раствор для разведения К-, К+, конъюгата и исследуемых сывороток (РРК)

Для получения РРК во все флаконы с желатиновой смесью добавляют по 4,0 мл подогретой (50-55 °С) дистиллированной воды, содержимое флаконов объединяют, к смеси добавляют 40 мл ПР.

4. КББ

Для получения раствора КББ содержимое флакона N 8 растворяют в 10 мл дистиллированной воды.

5. К+, К- и исследуемые сыворотки

В ампулы с К+ и К- добавляют дистиллированную воду по 0,1 мл и разводят как указано на этикетке. Исследуемые сыворотки разводят 1:400 и 1:800 на РКК.

6. ОФД. Готовят непосредственно перед употреблением.

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного двуводного (флакон N 12) растворяют в 3 мл дистиллированной воды (раствор А). Навеску лимонной кислоты (флакон N 13) растворяют в 3 мл дистиллированной воды (раствор В). Смешивают 2,5 мл раствора А и 2,5 мл раствора В, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой (цитратно-фосфатный буфер (ЦФБ) рН 5,0+-0,1). Навеску ОФД (флакон N 6) растворить в 10 мл ЦФБ, добавить 0,1 мл 3%-ного раствора перекиси водорода (флакон N 7), перемешать.

7. Конъюгат. Рабочее разведение.

Содержимое ампулы (0,01 мл) растворяют в РКК до титра, указанного на этикетке.

8. Антигены. Антигены регидрируют дистиллированной водой до первоначального объема (0,1 мл), затем добавляют 10 мл КББ.

Проведение иммуноферментного анализа

1. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антигена. Планшет накрывают крышкой, инкубируют 18 ч при (4-6) °С.

2. По окончании инкубации раствор антигена удаляют, планшеты промывают 3 раза ПР.

3. В лунки планшета А1, В1 вносят по 100 мкл раствора К+, в лунки С1, D1 - по 100 мкл раствора К-, в лунки Е1, F1, G1, H1 - по 100 мкл ФСБ. В остальные лунки планшета вносят по 100 мкл исследуемых сывороток, разведенных каждая 1:400 и 1:800 на РКК.

4. Планшеты накрывают крышкой и инкубируют 2 ч при 37 °С.

5. По окончании инкубации планшеты освобождают от содержимого, промывают 4 раза ПР.

6. Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата.

7. Инкубируют планшеты в закрытом виде 45 мин при 37 °С.

8. Удаляют содержимое лунок, планшеты промывают 4 раза ПР.

9. Во все лунки вносят по 100 мл раствора ОФБ.

10. Инкубируют 10-20 мин при температуре 20-25 °С в темном месте.

11. Для остановки реакции в каждую лунку добавляют по 50 мкл серной кислоты (флакон N 14).

Учет и интерпретация результатов

Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Установку "бланк" спектрофотометра осуществляют по лункам С1-Н1 каждого планшета. Оценку результатов исследования производят только в том случае, если средний показатель оптической плотности (ОП490) в К+ выше, чем в К-, не менее, чем на 0,5 ед. ОП490. Увеличение ОП490 на 0,3 ед. и более в сыворотке реконвалесцента по сравнению с сывороткой в том же разведении, полученной в острой фазе заболевания, расценивается как диагностически достоверное.

Адрес изготовителя: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17 НИИ гриппа; тел. 234-12-10, 234-58-75, 234-15-48 факс (812) 234-01-50

Начальник Управления
профилактической медицины
Минздравмедпрома России
Р.И.ХАЛИТОВ

Начальник Управления Государственного
санитарно-эпидемиологического надзора
и экспертизы Госкомсанэпиднадзора
России
В.И.ЧИБУРАЕВ

Приложение 5
к приказу Минздравмедпрома
и Госкомсанэпиднадзора РФ
от 19 апреля 1995 г. N 101/46