Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздравмедпрома РФ N 101, Госкомсанэпиднадзора РФ N 46 от 19.04.95 "О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ ОТ ГРИППА И ДРУГИХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"

Методы быстрой диагностики основаны на обнаружении вирусных антигенов в материалах от больных с помощью специфических антител, маркированных флуорохромами и ферментами. Они широко используются в инфекционных стационарах для выяснения природы сходных по клиническим проявлениям, но отличных по этиологии, острых респираторных вирусных заболеваний в целях:

- раннего назначения специфических средств этиотропной терапии;

- прогнозирования тяжести развития заболеваний;

- рационального размещения больных по этиологическому принципу (во избежание перекрестного внутрибольничного инфицирования).

Методы ранней лабораторной диагностики используют также для быстрой расшифровки природы эпидемических вспышек в целях проведения соответствующих профилактических и лечебных мероприятий.

В последние годы в практике здравоохранения широкое распространение получил метод иммунофлуоресцентой диагностики гриппа и других ОРЗ. Наряду с ним внедряется и новый метод ранней диагностики гриппа, основанный на применении иммуноферментного анализа.

2.1. Метод иммунофлуоресцентной
диагностики гриппа и других ОРЗ (МИФ)

Прямой метод иммунофлуоресцентного анализа позволяет обнаружить вирусные антигены по их характерной локации непосредственно в клетках цилиндрического эпителия за счет взаимодействия антигенов со специфическими противовирусными антителами, меченные флуоресцеинизотиоцианатом. По чувствительности МИФ не уступает другим методам лабораторной диагностики, однако, для правильной интерпретации результатов необходим определенный опыт работы. Тщательная микроскопия мазков требует значительного внимания и времени, что ограничивает возможности исследований и приносит элементы субъективизма в заключительный анализ.

К числу преимуществ метода относится возможность быстрого анализа небольшого числа проб (за 2-3 часа). Анализ наиболее эффективен в острой фазе (первые 3 дня) заболевания и существенно зависит от качества забора клинических материалов.

Используемые материалы: сухие тампоны из стерильной ваты, пробирки, марлевые салфетки, пинцет, обезжиренные предметные стекла, лейкопластырь, планшеты для предметных стекол, пастеровские пипетки, стеклянный сосуд для фиксации мазков, мерные пипетки, фильтровальная бумага, влажная камера для окраски препаратов, сосуд для промывания.

Растворы: 0,01 моль/л фосфатно-солевой буферный раствор (ФЕР) рН 7,4-7,5 (Na2HPO4.2H2O - 7,12 г, КН2РО4 - 1,38 г, NаСI - 42,5 г на 5 л дистиллированной воды), иммерсионное масло (диметилфталат).

Оборудование: люминесцентный микроскоп с масляным иммерсионным объективом, лабораторная центрифуга, термостат (+37°С), холодильник (+4°С), настольный вентилятор, ионометр, весы торсионные.

Для получения клинических материалов поочередно в обе полости носа больного на глубину 2-3 см вводят тампон легким движением по наружной стенке носа. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход, прижимают наружную стенку носа и вращательными движениями тщательно снимают десквамированный эпителий. Тампоны погружают в пробирку с 2 мл ФБР. Взятые материалы быстро (в течение 1-4 ч) доставляют в лабораторию.

Для получения осадка клеток цилиндрического эпителия пробирки с тампонами в ФБР энергично встряхивают, тампоны отживают и удаляют. Полученную суспензию клеток центрифугируют в течение 5-7 мин при 500-600 g. Надосадочную жидкость удаляют, осадок суспендируют пастеровской пипеткой в нескольких каплях остающейся на дне жидкости и используют для приготовления мазков, которые наносят на тщательно обезжиренные чистые предметные стекла (последние хранят до использования в этиловом 96° спирте). Стекла высушивают, маркируют, на каждое из них наносят по восемь капель осадка клеток и готовят мазки диаметром 6-7 мм, расположенные в шахматном порядке, которые высушивают при комнатной температуре под вентилятором. Затем мазки фиксируют, погружая стекла на 10 мин в химически чистый безводный ацетон, предварительно охлажденный до 2-4°С. Полученные препараты используют для окраски флуоресцирующими антителами (ФА).

Мазки от каждого больного окрашивают антителами к вирусам гриппа А (H1N1), А (H3N2), В, парагриппа 1, 2 и 3 типов, РС-вирусу и аденовирусам. С этой целью сухие препараты ФА регидратируют до исходного объема, указанного на этикетке, дистиллированной водой, выдерживают 5 мин при комнатной температуре до полного растворения препарата. После этого проводят центрифугирование конъюгатов (5-7 мин) при 6000 g, для окраски используют надосадочную жидкость. Восстановленный конъюгат фасуют по 0,1 мл и хранят при температуре не выше -10°С в течение 3-4 мес. Для проведения 160 анализов достаточно 1 мл конъюгата с рабочим разведением 1:8.

Техника окраски

Готовят рабочее разведение ФА на ФБР в соответствии с указанием на этикетке (срок хранения - не более 2 недель при +4°С). Предметные стакла с фиксированными мазкамипомещают во влажную камеру, на нижний мазок наносят каплю флуоресцирующего иммуноглобулина в рабочем разведении.

Стекла с мазками обрабатывают ФА в течение 30 мин при комнатной температуре (18-22°С) или в течение 20 мин при 37°С во влажной камере. Затем препараты вынимают, стряхивают с них капли ФА, споласкивают стекла в дистиллированной воде и помещают в сосуд с ФБР для промывания мазков (2 раза по 10-15 мин при комнатной температуре). Далее препараты споласкивают дистиллированной водой и высушивают в вертикальном положении при комнатной температуре под вентилятором.

Учет результатов

Мазки просматривают с масляной иммерсией, обращая внимание на число и тип клеток, уровень их свечения, наличие флуоресцирующих включений. В препаратах из носовой полости человека наиболее часто встречаются клетки цилиндрического эпителия, плоские эпителиальные клетки, лейкоциты. Диагностическое значение имеет выявление специфического свечения в клетках цилиндрического эпителия, имеющих бокаловидную форму или округлую форму с относительно крупным ядром и малой цитоплазматической зоной. Мелкие лейкоциты и крупные полигональные клетки с мелким ядром (плоского эпителия) при диагностике во внимание не принимаются. Следует учитывать результаты микроскопии только тех мазков, в которых содержится не менее 15 клеток цилиндрического эпителия. Интенсивность свечения клеток оценивают по общепринятой четырехкрестовой шкале. Свечение в клетках чаще всего локализуется в цитоплазме, хотя с ФА к гриппу и аденовирусам можно видеть специфическую флуоресценцию и в ядрах клеток. Диагностически доказательным является обнаружение не менее 3 клеток цилиндрического эпителия с отчетливо видимым зеленоватым специфическим свечением, яркость которого оценивается на один крест и более.

Используются для ранней дифференциальной диагностики гриппа типа А или В путем выделения вирусных антигенов в носоглоточных секретах (аспираты, смывы) от больных с симптомами ОРЗ. Преимуществом ИФА перед МИФ является его высокая чувствительность, возможность одновременного анализа большого числа клинических материалов, объективный количественный учет результатов.

Метод может быть использован для мониторинга инфекционного и вакционального процесса, для изучения острых и хронических форм вирусных инфекций, расшифровки природы эпидемических вспышек и индивидуальной диагностики.

Способ применения

Подготовка материала для исследования. Материалом для исследования служит отделяемое носовой полости у больных с симптомами ОРЗ, которое получают путем аспирации секретов с помощью устройства для забора жидкости, подсоединяемого к вакуумному насосу. Секреты перед исследованием разводят в 5 раз ФСБ с 0,05% твина-20. Допустимо использование носоглоточных смывов или мазков из области нижних носовых ходов, мягких соскобов с трахеи (в условиях специализированных клиник). В этом случае слизь и клеточное содержимое, снятые ватными тампонами, ресуспендируют в 2 мл ФСБ, содержащего 0,05% твина-20. Материалы от больных перед исследованием подвергают двукратному замораживанию-оттаиванию для высвобождения клеточных антигенов. Их можно хранить в течение 3-4 мес. при температуре от -15 до -25 °С.

Материалы и оборудование: планшеты для иммуноферментного анализа однократного применения, многоканальный спектрофотометр отечественного (АИФ-Ц-01С) или зарубежного производства (мультискан), регулируемые микропипетки одноканальные на 10-50 мкл и на 50-250 мкл, а также 8-канальные - на 50-250 мкл, устройство для забора жидкости однократного применения, электроотсос, ионометр, термостат, низкотемпературный прилавок, бытовой холодильник, иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов вирусов гриппа типа А или В (ИФТС "Грипп-виротест").

Состав ИФТС "Грипп-виротест":

1. Антитела к вирусу гриппа типа А (или В) - 1 амп.

2. Положительный контрольный образец вируса гриппа (К+) - 1 амп.

3. Отрицательный контрольный образец вируса гриппа гетерологичного типа), (К-) - 1 амп.

4. Антитела к вирусу гриппа, меченные пероксидазой хрена (Кон) - 1 амп.

5. Карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ) - 1 фл.

6. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) - 1 фл.

7. Натрий хлористый - 1 фл.

8. Смесь желатина с сахарозой - 2 фл.

9. Твин - 20 - 1 фл.

10. Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1 фл.

11. Кислота лимонная - 1 фл.

12. Ортофенилендиамин - 1 фл.

13. Перекись водорода (3% раствор) - 1 фл.

14. Кислота серная (1 моль/л) - 1 фл.

15. Планшет для ИФА - 2 шт.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Содержимое флакона N5 (32 мг натрия углекислого и 58,4 мг натрия углекислого кислого) растворяют в 20 мл дистиллированной воды.

Раствор 2. 53 мг желатины и 750 мг сахарозы растворяют в 1 мл дистиллированной воды при температуре 55 °С. Содержимое 2-х флаконов (по 1,5 мл) объединяют.

Раствор 3. Содержимое флакона с ФСБ (712 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,136 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 4,25 г натрия хлористого) растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

Раствор 4. К 500 мл раствора 3 добавляют 250 мкл твина-20.

Раствор 5. К 320 мл раствора 4 добавляют 6,64 г натрия хлористого.

Раствор 6. К 18 мл раствора 4 добавляют 3 мл раствора 2.

Раствор 7. 0,216 г натрия фосфорнокислого двузамещенного растворяют в 6 мл дистиллированной воды (раствор В). Смешивают 5,1 раствора А и 4,9 мл раствора В, объем доводят до 20 мл дистиллированной водой (ЦФБ).

Раствор 8. 20 мг ортофенилендиамина растворяют в 20 мл раствора 7, добавляют 0,2 мл 3% раствора перекиси водорода (раствор 8 готовят непосредственно перед употреблением).

Раствор 9. Содержимое ампулы с антителами растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Затем препарат антител разводят с помощью раствора 1 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Раствор 10. Содержимое ампулы с антителами, меченными пероксидазой, растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат конъюгата (Кон) доводят с помощью раствора 6 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Раствор 11. Содержимое ампулы с К+ растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат К+ разводят с помощью раствора 4 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Раствор 12. Содержимое ампулы с К- растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат К- разводят с помощью раствора 4 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Примечание: иммунореагенты тест-системы после растворения хранить при температуре 4-8 °С не более 15 сут.

Проведение ИФА:

1. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антител к вирусу гриппа в рабочем разведении.

2. Планшет закрывают крышкой и выдерживают при температуре 4-8 °С в течение (18+-2) ч.

3. По завершении адсорбции антител жидкость из лунок удаляют встряхиванием перевернутого планшета и постукиванием по фильтровальной бумаге. Лунки планшета при комнатной температуре промывают 3 раза по 0,2 мл раствора 4 и 1 раз - дистиллированной водой. Планшет осушают.

4. В 8 краевых лунок первого ряда вносят по 100 мл раствора 4.

5. Рабочие растворы К+ и К- вносят по 100 мл в лунки второго ряда (по 2 лунки на каждый).

6. Исследуемые материалы от больных вносят по 100 мкл (в 2 лунки каждый).

7. Планшеты закрывают и выдерживают при температуре 4-6 °С в течение 18 ч.

8. Содержимое лунок удаляют, планшеты промывают 4 раза раствором 5 и 1 раз - дистиллированной водой.

9. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл Кон в рабочем разведении.

10. Планшеты закрывают и инкубируют 2 ч при температуре (20+-3)°С в течение 2 ч.

11. Планшеты промывают как указано в п.8.

12. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора 8.

13. Планшеты инкубируют 4-5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте (до появления желтого окрашивания в лунках с К+).

14. Реакцию останавливают внесением в лунки по 50 мкл раствора серной кислоты.

Учет результатов

Результаты учитывают с помощью спектрофотометра (мультискана) зарубежного или отечественного производства (типа АИФ-Ц-01С) при длине волны 490 нм. По показаниям прибора рассчитывают среднюю величину оптической плотности (ОП490) раствора в контрольных лунках первого ряда (Мк). Значение Мк должно быть не выше, чем 0,07. Средняя величина ОП490 растворов в двух лунках с положительными контрольными образцами (М+) должна быть не ниже, чем 0,35, а отклонения значений ОП490 в дубликатах проб с К+ от М+ - не более 20%. Значения ОП490 раствора в лунках с Кдолжны быть не выше, чем 0,1.

К числу положительных (содержащих вирус гриппа соответствующего типа) относят те из исследуемых проб, значения ОП490 по которым превышают значения Мк не менее, чем в 1,6 раза.

Предосторожности в работе

При работе с вируссодержащими материалами от больных все операции следует выполнять в масках, не допускается пипетирование ртом, все использованные материалы следует подвергать обработке хлорамином (3% раствор) в течение 18 ч. Необходимо избегать попадания раствора ортофенилендиамина на кожу и слизистые, в случае контакта - промыть большим количеством воды.