Законодательная база Российской Федерации

"ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.7.1189-03" (утв. Главным государственным санитарный врачом РФ 30.01.2003)

После идентификации культуры бруцелл проверяют на диссоциацию. С этой целью применяют следующие тесты: проба с трипафлавином и реакция термоагглютинации (проба с нагреванием).

Проба с раствором трипафлавина (на стекле).

На предметное стекло наносят каплю солевого (0,85%) раствора трипафлавина 1:500, в котором эмульгируется капля испытуемой культуры. У диссоциированных культур быстро через 1 - 2 минуты наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь из S-форм культур остается гомогенной.

Реакция термоагглютинации.

2 - 3 мл 1 x 10(9) мкл/мл двухсуточной культуры бруцелл в физиологическом растворе подогревают в пробирке на водяной бане при 90° в течение 30 минут. Результаты учитывают через 30 минут, 1 час и окончательно через 24 часа пребывания при комнатной температуре. В эти сроки наступает, при наличии диссоциации, ясно выраженная агглютинация клеток бруцелл, тогда как суспензия недиссоциированных (S) штаммов остается гомогенной. Дифференциации подлежат культуры бруцелл, находящиеся только в S-форме.

Тестами дифференциации бруцелл являются: их отношение к росту в присутствии CO2, образование H2S, устойчивость к фуксину и тионину, способность агглютинироваться монорецепторными сыворотками, отношение к фагу "Тб".

Дифференциация по образованию сероводорода.

В качестве реактива применяют водный раствор уксусно-кислого свинца, в котором смачивают полоски фильтровальной бумаги размером 1 x 8 см. Полоски затем просушивают. Заготовленные впрок сухие полоски фильтровальной бумаги хранят в банке из темного стекла с притертой пробкой не более 1 - 2 месяцев.

Взвесь испытуемой культуры в физиологическом растворе (2 x 10(9) мкл в 1 мл) засевают стандартной петлей (2 мм) на скошенную поверхность печеночного агара (pH - 6,8 - 7,2). Затем берут полоску фильтровальной бумаги и зажимают между пробиркой и ватной пробкой так, чтобы нижний ее конец свободно свисал над верхним краем посева и не касался агаровой среды. Ватная пробка должна быть рыхлой, не задерживать выхода из пробирки углекислоты. Пробирки с посевами ставят в термостат при 37 °C.

Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего, свисающего над посевом конца бумажки. Почернение бумажки измеряется в мм.

Результаты учитываются через 2 дня в течение 6 дней. При каждом учете темневшую бумажку заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода все три показателя складывают.

Для В.suis (биовар 1) суммарный показатель образования сероводорода равен примерно 12 - 20 мм, для В.abortus (биовар 1) - около 5 - 7, В.melitensis (биовар 1), как правило, совсем не образует сероводорода или вызывает только легкое побурение свинцовой бумажки. У штаммов В.neotomae показатель образования сероводорода в среднем равен 5 - 8 мм. Культуры В.ovis и В.canis сероводорода не образуют.

Дифференциация по редуцирующей активности в отношении красок.

Для этого метода дифференциации рекомендуется применять твердые питательные среды - агар Albimi и мясо-пептонный агар. Применяют основной фуксин и тионин, предварительно оттитрованные по отношению к трем основным видам референтных штаммов бруцелл, в концентрации: фуксин - 1:50000, тионин - 1:50000.

При отсутствии стандартных оттитрованных красок рабочие их дозы можно оттитровать с использованием эталонных штаммов бруцелл. Для этого испытуемые краски добавляют к среде в различных концентрациях. Концентрация красок в среде, с которой получается четкая дифференциация эталонных штаммов бруцелл (В.melitensis 16M, В.abortus 544, В.suis 1330), и являются рабочей дозой данной краски. Основные растворы фуксина и тионина готовят в концентрации 1:1000 (0,1 г краски, 20 мл 96° спирта и 80 мл дистиллированной воды). Флаконы с краской хранят в темном месте в течение 6 - 10 месяцев. Готовят питательную среду с краской следующим образом: к 100 мл охлажденного до 45 - 50 °C агара стерильно добавляют 2 мл основного раствора краски для получения концентрации 1:50000.

Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20 - 25 мл в каждую чашку Петри. Затем среду подсушивают, не открывая чашки. Среды с красками должны храниться в холодильнике (+4 °C) и пригодны для работы в течение 10 - 15 дней. Обесцвеченные среды применять нельзя.

Взвесь бруцелл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы контрольных (эталонных штаммов всех трех видов бруцелл) и испытуемых штаммов производят петлей диаметром 2 мм из взвеси, содержащей в 1 мл 2 млрд. микробных клеток (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Одну петлю такой взвеси засевают штрихом на поверхность агара. На чашку можно одновременно засевать 4 - 6 культур, предварительно разделив чашку Петри на 4 - 6 секторов. Посевы помещают в термостат при 37 °C. Учет результатов проводят через трое суток инкубации.

Схема учета:

- интенсивный рост по всему штриху 4+;

- интенсивный рост вначале и более слабый в конце штриха 3+;

- менее интенсивный в начале или слабый рост по всему штриху 2+;

- очень слабый рост по ходу штриха или отдельные колонии +.

Реакция агглютинации с монорецепторными и R-сыворотками.

Монорецепторную сыворотку последовательно разводят до ее предельного титра (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. в объеме 0,5 мл). В качестве антигена применяют смыв в физиологическом растворе 2-суточной агаровой культуры бруцелл изучаемого штамма, разведенного до 2 млрд. микробных клеток в 1 мл (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Для разведения сыворотки и антигена применяют физиологический раствор, pH 7,0. Антиген добавляют по 0,5 мл во все пробирки. Разведение сыворотки удваивается (1:10, 1:20 и т.д.).

Реакцию ставят с двумя контролями: а) контроль с эталонным штаммом вида В.melitensis; б) контроль с эталонным штаммом В.abortus. Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37 °C 18 - 20 часов, а затем в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого проводят учет реакции. Реакция считается положительной, начиная с разведения сыворотки 1:20 , но не менее чем на 2+.

Для культур бруцелл вида ovis и canis, а также для культур других видов и биоваров бруцелл, находящихся в R-форме, для реакции агглютинации используют анти-R-сыворотку. Техника постановки реакции аналогична. Используется физиологический раствор на фосфатном буфере, pH 8,2 - 8,4.

Определение чувствительности культур бруцелл к фагу.

Бруцеллезный фаг "Тб" избирательно лизирует бруцеллы вида abortus, находящиеся в S-фазе. При определении чувствительности бруцелл к фагу используют следующий метод:

Питательная среда - 1,5% мартеновский агар (можно 1,5% агар Альбими) разливают в чашки Петри по 25 - 30 мл. Среду подсушивают при комнатной температуре в течение 18 - 20 часов. Чашки можно открыть и прикрыть их стерильными кружками фильтровальной бумаги, но в этом случае желательно чашки держать под лучами бактерицидной лампы.

Для посева используют 48-часовую агаровую культуру бруцелл, из которой готовят взвесь в физиологическом растворе из расчета 1 x 10(9) мкл в 1 мл, 0,4 - 0,5 мл из этой взвеси наливают на поверхность агара. Затем чашки тщательно раскачивают для получения равномерного газона, лишнюю посевную жидкость удаляют пастеровской пипеткой.

Засеянные чашки подсушивают в течение 1 часа при температуре 37 °C. На газон наносят пастеровской пипеткой по одной капле фага в концентрации по 10 x 10(2) корпускул фага в 1 мл. Чашки быстро наклоняют и капли фага стекают по дорожке. Места нанесения капель и путь стекания капли можно заранее расчертить карандашом на внешней стороне дна чашки.

Учет результатов.

Полный лизис культуры на месте нанесения фага (или по дорожке) "4+", лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или слившиеся бляшки в виде сот "3+". Резко ослабленный рост и небольшое количество бляшек "2+", очень слабый лизис "+" и отсутствие лизиса "-" - результат отрицательный.

Оценка результатов.

За положительный результат следует принимать лизис культуры минимум на два креста на месте нанесения капли фага. В качестве контроля рекомендуется включать референтные штаммы В.melitensis 16M, В.abortus 544 и В.suis 1330.

Дифференциальные свойства видов и сероваров рода Brucella: см. таблицу.