Законодательная база Российской Федерации

"ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.7.1189-03" (утв. Главным государственным санитарный врачом РФ 30.01.2003)

РНАт является модификацией реакции пассивной гемагглютинации и основана на нейтрализации антител специфическим антигеном, находящимся в исследуемом материале. Тем самым специфическая сыворотка лишается способности агглютинировать эритроциты, сенсибилизированные специфическим антигеном.

РНАт применяется для обнаружения бруцеллезного антигена в патологическом материале, пищевых продуктах и объектах внешней среды.

Подготовка исследуемого материала.

Материал, подозрительный на зараженность бруцеллами, перед постановкой реакции следует обезвредить путем прогревания при 100 °C (в кипящей водяной бане) в течение 10 минут. Жидкости (вода, молоко) прогревают в нативном виде. После прогревания воду и молоко центрифугируют при 3000 об./мин. 2 часа и берут для исследования осадок. Кусочки органов, брынзу и другой материал предварительно измельчают и растирают в ступке с добавлением 9 объемов физиологического раствора, полученную суспензию прогревают. Прогретую суспензию фильтруют через 2 слоя марли или бумажный фильтр и исследуют фильтрат или же центрифугируют его и берут для реакции надосадочную жидкость и осадок.

Реакцию ставят в полистироловых пластинах с лунками, которые должны быть тщательно вымыты, т.к. реакция отличается высокой чувствительностью и присутствие даже следов антигена может исказить ее результаты. Для постановки РНАт нужны те же ингредиенты, что и для РПГА, и, кроме того, взвесь убитых бруцелл

8 в концентрации 5 x 10 мкл/мл и бруцеллезная сыворотка с высоким титром гемагглютинирующих антител.

Бруцеллезную сыворотку предварительно титруют в РПГА, определяя ее предельное разведение, дающее реакцию не менее чем 3+. Это разведение принимают за одну сывороточную гемагглютинирующую единицу. Для РНАт берут разведение сыворотки, соответствующее 4 единицам. Например, если 1 единица соответствует разведению 1:25600, то 4 единицы - 1:6400. Поскольку в РНАт бруцеллезная сыворотка берется в объеме 0,25 мл, ее следует разводить в удвоенном титре (титр 1:3200). Реакцию ставят в 4-х рядах лунок, первый ряд - опытный (8 - 10 лунок), остальные - контрольные (6 лунок).

В первом (опытном) ряду титруют испытуемый материал. Во втором ряду (контроль 1) контролируется возможность неспецифической реакции за счет тканевых антигенов или гетерогенных антител. В третьем ряду (контроль 2) контролируется специфичность РНАт с заведомо бруцеллезным антигеном. В четвертом ряду (контроль 3) проверяется активность бруцеллезной сыворотки.

Если одновременно исследуют несколько проб, то для каждой пробы ставят только 1-й контроль, а второй и третий контроли ставят для всей партии проб.

Техника постановки РНАт.

В лунки первого, второго и третьего рядов вносят нормальную сыворотку кролика (разведенную 1:100) по 0,25 мл, а в четвертый ряд по 0,5 мл в каждую лунку, кроме первой лунки. Затем в 1-е лунки опытного и второго (контроль 1) рядов вносят по 0,25 мл исследуемого материала и титруют. В третий (контроль 2) ряд вносят бруцеллезный антиген в объеме 0,25 мл и также титруют. Во все лунки 1-го (опытного) и 3-го (контроль 2) рядов добавляют по 0,25 мл положительной бруцеллезной сыворотки 4 сывороточных гемагглютинирующих единиц (например, 1:3200).

Во все лунки второго (контроль 1) ряда добавляют 0,25 мл нормальной сыворотки кролика (1:100). В четвертом (контроль 3) ряду разводят бруцеллезную положительную сыворотку в объеме 0,5 мл, начиная с разведения, которое было использовано в первом (опытном) и третьем (контроль 2) рядах и проверяют соответствие разведения сыворотки 4-м сывороточным единицам (например, 1:6400). Пластины встряхивают и ставят в термостат при 37 °C на 2 часа. Затем во все лунки четырех рядов добавляют по 0,05 мл (1 капля) 2,5% взвеси бруцеллезного эритроцитарного диагностикума. Пластины встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 - 3 часа.

Учет реакции.

При наличии бруцеллезного антигена в исследуемом материале эритроциты выпадают в осадок в виде "пуговки" или маленького колечка - реакция нейтрализации положительная. Если в исследуемом материале антиген отсутствует, то специфические антитела, добавленные в реакцию, остаются свободными и склеивают эритроциты - реакция нейтрализации отрицательная.

За титр РНАт принимают последнее разведение исследуемого материала, которое вызывало полное подавление гемагглютинации. Результат РНАт считается положительным, если подавление гемагглютинации отмечается не менее чем в первых 2 - 3 лунках.

Техника постановки РНАт в микрообъемах.

В лунки микротитровальных пластинок вливают по 0,025 мл (1 капля) 1% нормальной сыворотки кролика. Затем титратором с головкой, вмещающей 0,025 мл, набирают исследуемый материал 1:5 - 1:10 и титруют переносом по 0,025 мл из одной лунки в другую в 7 - 8 разведениях. Из последней лунки 0,025 мл удаляют (так же, как в РПГА). После этого в лунки добавляют по 0,025 мл раствора бруцеллезной сыворотки в такой концентрации, чтобы в этом объеме содержалось четыре гемагглютинирующие единицы сыворотки. Пластины оставляют на 1 час при комнатной температуре и затем во все лунки добавляют по 0,025 мл диагностикума бруцеллезного эритроцитарного в концентрации 0,5%. За титр реакции принимают последнее разведение исследуемого материала, в котором отмечено полное подавление гемагглютинации.

Примечания. 1. Перед работой головки используемых титраторов следует предварительно обжечь.

2. При заборе материала для исследования и титрации нельзя прикасаться головкой титратора к стенкам пробирок или лунок титровальных пластинок, что может привести к удалению части жидкости.

3. Для заполнения титраторов достаточно погрузить их головки в исследуемую жидкость и убедиться в заполнении головок жидкостью.