Законодательная база Российской Федерации

"ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.7.1189-03" (утв. Главным государственным санитарный врачом РФ 30.01.2003)

РПГА является специфичным и высоко чувствительным методом выявления бруцеллезных антител в сыворотке крови человека. Для постановки РПГА необходимо иметь: а) бруцеллезный эритроцитарный антигенный диагностикум; б) контрольные (несенсибилизированные) эритроциты; в) нормальную сыворотку кролика; г) бруцеллезную сыворотку.

Для титрования испытуемых сывороток применяется нормальная сыворотка кролика, инактивированная при 56 °C в течение 30 минут и разведенная физиологическим раствором 1:100.

Испытуемую сыворотку разводят физиологическим раствором 1:25 (0,1 мл сыворотки +2,4 мл физиологического раствора) и инактивируют в течение 30 минут при 56 °C. Перед исследованием сыворотку адсорбируют 50% взвесью контрольных эритроцитов. К 1,2 мл инактивированной сыворотки добавляют 0,2 мл 50% эритроцитов, встряхивают и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Затем смесь центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 2 минут.

Можно оставить сыворотки с эритроцитами на ночь в холодильнике (+4 °C), в этом случае исключается центрифугирование.

Эритроцитарный диагностикум перед применением разводят физиологическим раствором (pH 7,0 - 7,2) согласно указанию на этикетке и получают 2,5%-ную взвесь, которая применяется в РПГА. Контрольные (несенсибилизированные эритроциты также разводят согласно указанию на этикетке и применяют полученную 2,5%-ную взвесь для контроля сывороток).

Техника постановки РПГА.

Реакцию ставят в прозрачных полистироловых пластинках с лунками. Каждую сыворотку исследуют не менее чем в 6 - 8 разведениях, начиная с 1:50. Сначала нормальную разведенную 1:100 инактивированную сыворотку кролика разливают во все лунки по 0,5 мл. Затем в первую лунку (контроль сыворотки) вносят 0,5 мл испытуемой сыворотки, предварительно инактивированной и разведенной 1:25, перемешивают и 0,5 выливают. Во вторую лунку также добавляют 0,5 мл испытуемой сыворотки (1:25), перемешивают, переносят 0,5 мл в третью лунку и титруют сыворотку до конца ряда, из последней лунки 0,5 мл выливают. Таким образом получают ряд последовательных двукратных разведений испытуемой сыворотки, начиная с 1:50, в объеме 0,5 мл.

В первые лунки (контроль сыворотки) добавляют микропипеткой по 0,05 мл контрольных эритроцитов. Затем в каждую лунку, начиная со второй, с помощью микропипетки добавляют по 0,05 мл диагностикума. Пластины осторожно встряхивают до полного перемешивания содержимого лунки, следя, чтобы не было разбрызгивания жидкости, и оставляют при комнатной температуре. Учет реакции проводят через 2 - 3 часа.

При постановке РПГА предусматриваются следующие контроли:

а) контроль качества нормальной сыворотки кролика (1:100) проводят в двух лунках. К 0,5 мл сыворотки добавляют в первую лунку 0,05 мл 2,5% взвеси диагностикума, во вторую - 0,05 мл контрольных эритроцитов;

б) качество диагностикума проверяют путем титрования специфической бруцеллезной сыворотки, начиная с разведения 1:50 до 1:100000. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 мл 2,5% взвеси диагностикума.

Реакция считается специфической, если в контролях исследуемых и контрольной сыворотки отсутствует гемагглютинация, а титр специфической сыворотки в реакции будет соответствовать титру, указанному на этикетке флаконов эритрицитарного диагностикума.

Оценка реакции проводится по следующей схеме:

4+ - эритроциты покрывают все дно лунки равномерным слоем, иногда наблюдается зонтик.

3+ - эритроциты выстилают все дно лунки тонким равномерным слоем, но площадь его меньше, чем при 4-крестовой реакции, размеры зонтика также меньше.

2+ - агглютинат небольшой, расположен в центре лунки.

1+ - вокруг осадка эритроцитов в центре виден небольшой агглютинат.

Отрицательная реакция - осадок эритроцитов на дне лунки в виде пуговки или маленького кольца.

За титр сыворотки принимают ее последнее разведение с оценкой реакции не менее чем 3+. Оценка результатов исследования сывороток на бруцеллез в РПГА у людей: титр 1:50 - реакция сомнительная, титр 1:100 и выше - реакция положительная. При записи результатов РПГА следует указывать титр сыворотки.

Техника постановки РПГА микрометодом.

РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками), который позволяет проводить титрование в объемах 25 и 50 мкл. Техника постановки реакции, последовательность всех операций такая же, как и при использовании макрометода. Следует учитывать то, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение ниже, чем макрометода.

Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки-капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забираем исследуемую сыворотку, погружая в нее головку. Титратор с сывороткой переносят в первую лунку и делают несколько вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной водой путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и обжигают ее на пламени горелки.

В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного диагностикума, разведенного 1:10, пластины слегка встряхивают до получения гомогенной взвеси. Учет проводят через 2 - 3 часа по аналогичной схеме, как и при использовании макрометода.