Законодательная база Российской Федерации

"ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.7.1189-03" (утв. Главным государственным санитарный врачом РФ 30.01.2003)

Метод используется для выявления бруцеллезного антигена в объектах внешней среды, пищевых продуктах и биологических объектах, а также для идентификации выделенных культур бруцелл. Метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, возможностью количественной и автоматизированной оценки результатов, воспроизводимостью и стандартностью основных ингредиентов анализа. С помощью ИФА можно выявить бруцеллы в концентрации 1 x 10(3) - 1 x 10(4) мкл/мл или 1 - 5 нг/мл бруцеллезного растворимого антигена.

Для постановки ИФА используют иммуноферментную тест-систему для определения бруцеллезного антигена, в которую входят: иммуноглобулины бруцеллезные, бруцеллезный конъюгат, бруцеллезный антиген (ЛПС), набор солей, необходимых для приготовления буферных растворов, субстрат - ортофенилиндиамин (ОФД). Твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА, полистироловые планшеты для иммунологических реакций).

Выявление бруцеллезного антигена в ИФА происходит за счет специфического взаимодействия бруцеллезных иммуноглобулинов, сорбированных на планшете, с бруцеллезным антигеном, содержащимся в исследуемом материале. Образовавшийся комплекс "антиген + антитело" выявляют с помощью конъюгата (бруцеллезные антитела, меченные пероксидазой хрена).

Техника постановки ИФА.

1. Сенсибилизация твердой фазы. В лунки планшета вносят с помощью дозатора по 200 мкл раствора бруцеллезных иммуноглобулинов в рабочем разведении (20 мкг/мл) в 0,02М растворе ФСБ, pH 7,2. Планшеты помещают в термостат на 2 часа при 37 °C или в холодильник на 18 часов при 4 °C. После окончания адсорбции иммуноглобулины удаляют из лунок планшета встряхиванием и трехкратно отмывают раствором ФСБ, содержащим 0,1% твина-20.

2. Внесение исследуемого материала. Исследуемый материал в разведениях (двух- или десятикратных) на ФСБ + твин, содержащий 1% БСА, вносят по 100 мкл в каждую лунку. Параллельно с исследуемыми образцами готовят серию последовательных разведений контрольного образца бруцеллезного антигена в концентрациях от 1 до 1000 нг/мл и каждое разведение антигена вносят в количестве 100 мкл в лунки планшета. Планшеты выдерживают в термостате при 37 °C в течение часа, после чего жидкость из планшета удаляют встряхиванием и планшеты отмывают, как указано в п. 1.

3. Внесение конъюгата. В каждую лунку вносят по 100 мкл раствора коньюгата в рабочем разведении (коньюгат разводят на ФСБ + твин, содержащий 1% БСА). Планшеты помещают в термостат на 40 мин., а затем отмывают, как указано в п. 1.

4. Проявление реакции. В каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного раствора, содержащего 0,04% ОФД и 0,04% H2O2 в 0,1М цитратно-фосфатном буфере, pH 5,5. Планшеты помещают в темное место при комнатной температуре на 15 - 20 мин. Реакцию останавливают внесением в лунки 50 мкл серной кислоты в концентрации 0,5 моль/л.

5. Оценка результатов. Оценку результатов проводят по изменению окраски субстрата (от светло-коричневой до оранжево-коричневой) визуально или с помощью фотометра при длине волны 492 нм, сравнивая интенсивность окраски контрольных и опытных проб. Появление желто-оранжевого окрашивания в опытных лунках и положительном контроле при его отсутствии в лунках с отрицательными контролями свидетельствует о наличии в пробе бруцеллезного антигена. При фотометрическом учете результатов анализа проба считается положительной, если ее оптическая плотность (ОП) в 2 и более раз превосходит наивысшее значение ОП отрицательных контролей, которое не должно превышать 0,2.