Законодательная база Российской Федерации

"ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.7.1189-03" (утв. Главным государственным санитарный врачом РФ 30.01.2003)

Метод используют для диагностики всех форм заболевания, а также при эпидемиологическом обследовании населения и при отборе лиц для вакцинации против бруцеллезной инфекции.

Для постановки ИФА используют диагностическую тест-систему, иммуноферментную для определения бруцеллезных антител. Выявление специфических антител в сыворотках людей происходит за счет взаимодействия бруцеллезного антигена (ЛПС), адсорбированного на полистироловом планшете (плоскодонном) с антителами исследуемой сыворотки. Образовавшийся комплекс "антиген + антитело" выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой хрена.

Тест-система представляет собой набор ингредиентов для проведения ИФА на твердофазном носителе и включает в себя: бруцеллезный ЛПС (либо планшет, сенсибилизированный этим антигеном), антитела против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой (конъюгат), контрольные (положительную и отрицательную) сыворотки человека, набор солей, необходимых для приготовления буферных растворов, субстрат - ортофенилиндиамин (ОФД). Твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА), планшеты для ИФА однократного применения.

Техника постановки ИФА.

1. Сенсибилизация твердой фазы. В лунки планшета вносят с помощью дозатора по 200 мкл раствора бруцеллезного антигена в концентрации 10 мкг/мл в 0,02М растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ), pH 7,2. Адсорбцию антигена на планшетах проводят в течение 2 часов в термостате при температуре 37 °C или при 4 °C в течение 18 часов. Затем антиген удаляют встряхиванием планшета с последующей трехкратной отмывкой (по 5 мин.) раствором ФСБ, содержащим 0,1% детергента - твит-20.

2. Внесение исследуемого материала. Испытуемые сыворотки, разведенные 1:200, вносят по 100 мкл в первую лунку ряда и далее последовательно путем двукратных разведений на ФСБ + твин, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), раститровывают. Параллельно на каждом планшете ставят отрицательный и положительный контроль. Планшеты встряхивают и выдерживают при 37 °C в течение 1 часа. После чего жидкость удаляют и отмывают планшеты, как указано в п. 1.

3. Внесение конъюгата. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении (конъюгат разводят на ФСБ + твин и 1% БСА). Планшеты помещают в термостат на 40 мин., после чего жидкость удаляют, а планшеты отмывают 4 - 5 раз, как указано в п. 1.

4. Проявление реакции. В каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного раствора, содержащего 0,04% ОФД и 0,04% H2O2 в 0,1М цитратно-фосфатном буфере, pH 5,5. Инкубацию проводят при комнатной температуре 15 - 30 мин. и останавливают реакцию внесением 50 мкл 0,5 моль/л серной кислоты.

5. Учет и оценка результатов ИФА. Результат реакции можно учитывать визуально с помощью сравнивания окраски в опытных и контрольных лунках, а также с помощью спектрофотометра типа Multiskan при длине волны 492 нм. Появление желто-оранжевого окрашивания в опытных лунках при его отсутствии в лунках с отрицательными контролями свидетельствует о положительной реакции. При фотометрическом учете результатов проба считается положительной, если оптическая плотность (ОП) в 2 и более раз превосходит наивысшее значение ОП отрицательных контролей.

Диагностическим титром в ИФА считается разведение сыворотки более чем 1:400.

Использование ИФА в эпидемиологической практике.

При проведении массовых обследований на бруцеллез для постановки ИФА может быть использована не сыворотка крови, а цельная кровь. Для этого кровь из пальца, с помощью микропипетки, в объеме 10 мкл вносится в микропробирку с физиологическим раствором в объеме 1 мл. Пробирку встряхивают и затем либо центрифугируют при 1000 об./мин. 5 мин., либо дают отстояться в холодильнике при 4 °C в течение 18 часов. Таким образом получают разведение сыворотки 1:200. Для постановки ИФА используют надосадочную жидкость. ИФА как скрининг-тест можно ставить в 2 лунках микропланшета, при получении сомнительного или положительного результата ИФА повторяют в количественном варианте с последующей раститровкой надосадочной жидкости. При получении положительного результата необходимо исследовать сыворотку крови.