Законодательная база Российской Федерации

"ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЮДЕЙ ЛЕПТОСПИРОЗАМИ. 3.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 3.1.1128-02" (утв. Главным государственным санитарным врачом 03.07.2002)

Возбудители лептоспирозов людей и животных - спирохеты, относящиеся к виду Leptospira interrogans рода Leptospira, входящего в состав семейства Leptospiraceae порядка Spirochaetales. К роду Leptospira принадлежат также непатогенные лептоспиры-сапрофиты (вид Leptospira biflexa), средой обитания которых является вода естественных или искусственных водоемов и влажная почва. Морфологически патогенные и сапрофитные формы лептоспир неотличимы, поэтому их дифференциация проводится на основе серологических, культурально-биохимических критериев и генетических маркеров.

Типичная лептоспира представляет собой спиралевидное образование, обладающее характерной прямолинейной и ротационной подвижностью. Концы у микроба изогнуты в виде крючков, которые придают ему своеобразный, легко распознаваемый вид. В культурах некоторых штаммов большинство или все клетки имеют прямые концы (бескрючковые лептоспиры). Длина лептоспиры в среднем составляет 6 - 20 мю m, а поперечник равен 0,1 - 0,16 мю m. В зависимости от длины число завитков спирали достигает 20. При продолжительном культивировании in vitro отдельные клетки могут превышать среднюю длину в 2 - 3 раза. Напротив, в патологическом материале клетки лептоспир значительно короче, чем в культуре.

В жидких средах лептоспиры вращаются вдоль длинной оси и совершают возвратно-поступательные движения без полярной дифференциации. Делящиеся клетки часто энергично и резко изгибаются в точке намечающегося деления. В полужидких средах также наблюдаются изгибание, буравящая и змеевидная подвижность.

Лептоспиры относятся к медленнорастущим аэробным микроорганизмам и культивируются в средах, содержащих сыворотку, сывороточный альбумин или жирные кислоты с длинной цепью (14 или более атомов углерода). Эти вещества служат основным источником углерода и энергии, а также клеточных липидов. Лептоспиры могут утилизировать неорганические соли аммония (но не аминокислоты) как главный источник азота, а также пуриновые, но не пиримидиновые основания. Для их роста также необходимы тиамин (витамин B1) и цианкобаламин (витамин B12).

Как свежевыделенные, так и музейные штаммы лептоспир чувствительны к тетрациклину, пенициллину и стрептомицину.

Оптимальный рост лептоспир наблюдается при pH 7,2 - 7,6 (диапазон роста от 6,8 до 7,8), температурный оптимум 28 - 30 °C. Период инкубации для достижения оптимального роста обычно составляет 6 - 14 дней, но может варьировать от нескольких дней до 4 недель и более.

Лептоспиры способны проходить через мембранные фильтры со средним диаметром пор 0,22 мю m, что используется для очистки контаминированных культур от посторонней микрофлоры.

При кипячении лептоспиры погибают моментально, а при нагревании до 56 - 58° - в течение 25 - 30 мин. Они также быстро погибают при высушивании и под воздействием прямого солнечного света. К низким температурам лептоспиры весьма устойчивы и остаются жизнеспособными после длительного замораживания. Растворы 0,1%-ной соляной кислоты, 0,5%-ного фенола инактивируют лептоспир в течение 20 мин., активный хлор в дозе 0,3 - 0,8 мг/л - после двухчасовой экспозиции. Для обеззараживания чистых культур лептоспир рекомендуется использовать 2%-ный раствор соляной кислоты с экспозицией 24 ч, а патологического материала - 5%-ный раствор фенола с экспозицией 2 ч.

Лептоспиры - типичные гидрофилы. Важными условиями для их выживания во внешней среде являются повышенная влажность и pH в пределах 7,0 - 7,4. В воде открытых водоемов патогенные лептоспиры сохраняют жизнеспособность от 7 до 30 и более дней, а во влажной почве - до 270 дней. На пищевых продуктах - от нескольких часов до нескольких дней.

Патогенные лептоспиры отличает выраженное внутривидовое разнообразие по антигенным свойствам. Основной таксон - серовар. К настоящему моменту в мире идентифицировано более 230 сероваров патогенных лептоспир, объединенных на основании антигенного родства в 23 серологические группы (табл. 3). В соответствии с новой концепцией определения вида у бактерий, на основании результатов ДНК-ДНК гибридизации среди лептоспир выделены семь геномовидов.

Типовой штамм: Leptospira interrogans, серовар icterohaemorrhagiae, штамм RGA.

Сапрофитные лептоспиры характеризуются еще более выраженным антигенным и генетическим разнообразием, чем патогенные. Типовой штамм Leptospira biflexa: серовар patoc, штамм Patoc I.

Все больные с клиническим диагнозом "лептоспироз" или подозреваемые в заражении этой инфекцией в обязательном порядке должны быть обследованы лабораторными методами в соответствии с действующими рекомендациями. В связи с тем, что клиническая дифференциальная диагностика лептоспирозов представляет значительные трудности из-за полиморфизма клинической картины, результаты лабораторного обследования являются решающими для подтверждения лептоспирозной этиологии заболевания. Кроме того, установление серогруппы лептоспир, вызывавших заболевание, важно для проведения эпидемиологического обследования и целенаправленного поиска источника инфекции.

Современная лабораторная диагностика лептоспирозов основана на комплексе микробиологических и иммунологических методов, которые используются в различных комбинациях в зависимости от фазы заболевания и диагностических возможностей лаборатории.

Материалом для исследования являются кровь, моча, спинномозговая жидкость (СМЖ) больного, а при летальных исходах - паренхиматозные органы, грудной и брюшной транссудат.

В период лептоспиремии (1-я неделя болезни) для обнаружения лептоспир можно использовать микроскопию цитратной крови, посев крови, определение специфической ДНК лептоспир в крови методом ПЦР и заражение лабораторных животных.

С конца 1-й, начала 2-й недели в крови больных появляются специфические антитела, которые можно определить с помощью серологических реакций: микроагглютинации лептоспир (РМА), макроагглютинации на стекле (РА), иммуноферментного анализа и других методов.

Начиная со 2-й недели исследуют ликвор, с 3-й недели - мочу. В случае летальных исходов - паренхиматозные органы на присутствие лептоспир (микроскопия, посев, ПЦР, биопробы).

Лептоспиры плохо воспринимают окраску, поэтому все наблюдения проводят с живыми возбудителями в темном поле зрения микроскопа. С этой целью используют конденсор темного поля (например, ОИ-13) и осветитель ОИ-19 или другой системы.

Для выявления лептоспир методом микроскопии готовят препараты "раздавленная капля": небольшую каплю исследуемого материала наносят пастеровской пипеткой на предметное стекло толщиной не более 1,0 - 1,1 мм и накрывают покровным стеклом толщиной 0,2 мм. На верхнюю линзу конденсора микроскопа помещают каплю дистиллированной воды.

Ввиду значительной величины микроба для исследования пользуются сухими системами: объектив - X40, окуляр - X10. Методом микроскопии исследуют цитратную кровь, мочу или ликвор больного, а также ткань паренхиматозных органов трупа.

Для приготовления цитратной крови смешивают 2 объема крови и один объем 1,5%-ного раствора лимоннокислого натрия; смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Микроскопируют надосадочную жидкость. Более эффективна подготовка материала способом двойного центрифугирования. На первом этапе проводят осаждение эритроцитов при 3000 об./мин. в течение 15 мин. На втором этапе полученную надосадочную жидкость центрифугируют 30 мин. при 10000 об./мин. Полученный осадок микроскопируют. Метод микроскопии цитратной крови - простой и доступный метод ранней диагностики лептоспироза. Однако следует помнить, что ввиду его

6 низкой чувствительности (10 клеток/мл) и кратковременности периода лептоспиремии (около 1 недели) отрицательные результаты микроскопии цитратной крови не дают основания для исключения диагноза лептоспироз. На фоне антибиотикотерапии диагностическая эффективность микроскопического метода резко снижается. Для подтверждения диагноза и определения серогруппы возбудителя кроме микроскопии необходимо проводить серологические и бактериологические исследования. Мочу (средняя порция) и ликвор исследуют в нативном состоянии или методом центрифугирования.

Микроскопия мочи используется также с целью прижизненного обследования животных (в т.ч. свиней, собак и др.) на лептоспироносительство.

Ткань паренхиматозных органов (печень, почки и др.) забирают пастеровской пипеткой и смешивают на предметном стекле с каплей физиологического раствора. Через 2 - 3 мин. частицы ткани удаляют, каплю накрывают покровным стеклом и тотчас микроскопируют. Взвесь не должна быть слишком густой. При исследовании почек взвесь готовят из коркового слоя органа, где локализуются лептоспиры.

Сходным образом готовят препараты для микроскопии из почек грызунов и других животных при их исследовании на лептоспироносительство.

При микроскопических исследованиях следует учитывать следующие возможные ошибки:

- наличие в препарате образований (псевдоспирохет), по морфологии отдаленно напоминающих лептоспир, - нитей фибрина, стромы эритроцитов и т.д. От лептоспир их отличает отсутствие концевых крючков и активной подвижности;

- наличие в препарате других извитых форм микроорганизмов, например спирилл, особенно часто обнаруживаемых при исследовании несвежего патологического материала;

- дефекты покровного стекла при неправильной настройке микроскопа могут быть ошибочно приняты за лептоспиры;

- плохое освещение препарата: при правильном освещении всегда видны пассивно или активно двигающиеся частицы.

Значительно реже для обнаружения лептоспир в органах и тканях используют окраску мазков-отпечатков по Романовскому-Гимза, импрегнацию серебром гистологических срезов по Вартину-Стерри. С этой же целью можно также использовать метод иммунофлуоресценции и полимеразную цепную реакцию.

Принцип метода. В основе метода ПЦР лежит многократное копирование (амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени, который является маркерным для данного вида. Такое копирование осуществляется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой в присутствии дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (дНТФ) и синтетических олигонуклеотидных затравок синтеза ДНК, называемых праймерами. Праймеры комплементарны концевым последовательностям ДНК специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента

n по формуле 2 , где n - число циклов амплификации.

Каждый цикл состоит из трех этапов, каждому из которых соответствует определенный температурный режим.

1) Расплетение двойной спирали ДНК (денатурация ДНК) происходит при 93 - 95 °C.

2) Присоединение (отжиг) праймеров происходит комплементарно при температуре, специфической для данной пары праймеров.

3) Синтез новых цепей ДНК протекает при 72 °C путем удлинения праймера в направлении 5' - 3'. В результате 30 - 35 циклов амплификации синтезируется 10 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном геле.

Необходимое оборудование и реактивы

1. Микропипетки полуавтоматические на 1 - 10, 5 - 40, 40 - 200, 200 - 1000 мкл.

2. Микроцентрифуга на 8 - 12 тыс. об./мин. для пробирок объемом 1,5 и 0,5 мл.

3. Прибор для горизонтального электрофореза.

4. Программируемый термостат (ДНК-амплификатор).

5. Термостат на 45 - 55 °C для пробирок объемом 1,5 мл.

6. Ультрафиолетовый трансиллюминатор.

7. СВЧ-печь или водяная баня на 95 - 100 °C.

8. Встряхиватель для микропробирок (типа "Вортекс").

9. Тест-системы для определения ДНК Leptospira interrogans методом ПЦР.

Техника обработки клинического материала и проведения анализа изложены в инструкциях по применению амплификационных тест-систем фирмы-изготовителя.

В качестве исследуемого клинического материала используют кровь, сыворотку крови, СМЖ, мочу.

ПЦР-анализ характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью (от 10 до 1000 клеток в пробе) и высокой диагностической эффективностью на первой неделе заболевания (начиная с первых суток), даже на фоне антибиотикотерапии. Поэтому его можно рекомендовать как метод ранней экспресс-диагностики лептоспирозов. При тяжелом течении инфекции на фоне отсроченного синтеза специфических антител ПЦР может быть отнесена к методам выбора для быстрого лабораторного подтверждения клинического диагноза.

Вместе с тем отрицательный результат ПЦР-анализа не должен быть основанием для прекращения диагностического поиска, т.к. день начала болезни не всегда точно известен. Диагностическая чувствительность лабораторного анализа при лептоспирозах может быть значительно повышена за счет параллельного использования серологического теста (РМА) и ПЦР вне зависимости от фазы заболевания.

Бактериологическим методом исследуют тот же материал и в те же сроки, что и при использовании метода микроскопии. Лептоспиры относятся к медленнорастущим микроорганизмам, поэтому выделение культуры имеет значение только для ретроспективного подтверждения клинического диагноза "лептоспироз" и более детальной расшифровки этиологии случая или вспышки.

Исследуемый материал от больного - кровь, мочу, СМЖ в количестве 5 капель засевают в 3 - 5 пробирок с питательной средой или стерильной дистиллированной водой, желательно у постели больного.

При посеве из органов трупа человека или павшего сельскохозяйственного животного (почек, печени) после вскрытия брюшной полости во избежание загрязнения посевов шпателем осторожно прижигают поверхность органа. Затем в этом месте производят прокол пастеровской пипеткой на глубину 0,25 - 0,50 см и забирают межтканевую жидкость с элементами ткани, которые с соблюдением всех правил асептики переносят в пробирку или ампулу с питательной средой.

Трупы грызунов в связи с быстрым развитием трупного обсеменения исследуют в первые часы (не позднее 12 ч в зависимости от температуры воздуха) после гибели зверька. Грызунов вскрывают при строгом соблюдении асептики. Шкурку зверька смачивают 5%-ной спиртовой настойкой йода. Стерильными инструментами производят вскрытие брюшной полости. Почку извлекают и помещают в стерильную чашку Петри. Затем небольшие кусочки ткани почки, взятые пастеровской пипеткой, засевают на питательную среду. Инструменты в процессе вскрытия обжигаются.

Посевы следует производить в несколько (3 - 5) пробирок или ампул со средой, которые затем помещают в термостат и культивируют при температуре 28 - 30 °C.

Для культивирования лептоспир используют жидкие сывороточные питательные среды, основным компонентом которых является сыворотка кролика или барана (Терских, Фервоорта-Вольфа и др.), а также полусинтетические твин-альбуминовые среды.

Среда Терских. Наиболее простой и оптимальной для практического использования является фосфатно-сывороточная среда Терских. Для приготовления 1 л основы этой среды к 100 мл фосфатного буфера (pH = 7,2) добавляют 900 мл дистиллированной воды. Основу дважды фильтруют через двуслойный бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют в автоклаве при 120 °C в течение 20 мин.; пробирки с выпавшим после автоклавирования кристаллическим или аморфным осадком выбраковывают.

В серии пробирок с прозрачным содержимым выборочно проверяют pH. Для посевов используют среду с pH 7,2 - 7,6. В каждую пробирку добавляют в стерильных условиях инактивированную в течение 30 мин. при температуре 56 °C нормальную кроличью сыворотку в количестве 0,5 мл (10 капель на 5 мл среды). Приготовленная питательная среда может быть использована только после 2-кратного прогревания в водяной бане при 56 °C в течение 1 ч. После каждого прогревания среда контролируется на стерильность (при 37 °C в течение суток).

В основу среды Фервоорта-Вольфа помимо компонентов, входящих в среду Терских, добавляют пептон (1 г на 1 л основы) и NaCl (0,5 г на 1 л основы).

Твин-альбуминовая среда.

Основные растворы. Растворяют следующие ингредиенты (в 100 мл дистиллированной воды каждый): NH4Cl - 25 г; ZnSO4 x 7H2O - 0,4 г; MgCl2 x 6H2O и CaCl2 x 2H2O по 1,5 г каждый; FeSO4 x 7H2O - 0,5 г; пируват натрия - 10,0 г; глицерин - 10,0 г; твин-80 - 10,0 г; тиамин HCl - 0,5 г и цианкобаламин - 0,02 г. Раствор FeSO4 должен быть свежеприготовленным и прозрачным.

Растворяют 10 г бычьего сывороточного альбумина (V фракция) в 50 мл дистиллированной воды, размешивают на магнитной мешалке, добавляя следующие растворы: CaCl2 - MgCl2 - 1 мл; FeSO4 - 10 мл; цианкобаламин - 1 мл; твин-80 - 12,5 мл. Доводят PH до 7,4 и добавляют дистиллированную воду до конечного объема 100 мл. Альбуминовую добавку стерилизуют фильтрацией.

Для приготовления основы среды к 996 мл дистиллированной воды добавляют: Na2HPO4 (обезвоженный) - 1 г; K2HPO4 (обезвоженный) - 0,3 г и NaCl - 1 г. Затем добавляют следующие растворы: NH4Cl - 1 мл; тиамин - 1 мл; пируват натрия - 1,0 мл и глицерин - 1 мл. PH основы среды доводят до 7,4, а затем стерилизуют автоклавированием при 121 °C в течение 20 мин.

Для приготовления жидкой твин-альбуминовой среды 1 объем альбуминовой добавки смешивают с 9 объемами основы среды при соблюдении асептики.

Селективные среды. В качестве селективных могут быть использованы все перечисленные выше жидкие питательные среды после добавления в них 5-фторурацила в концентрации 100 мкг/мл.

Обработка посуды. При культивировании лептоспир следует пользоваться посудой из нейтрального или химического стекла. Обработка новой или бывшей в употреблении посуды производится в посудомоечной машине с использованием специальных детергентов или ручным способом. Процесс ручной обработки пробирок состоит из следующих этапов:

- погружение на 24 ч в 1 - 2%-ный раствор соляной кислоты;

- многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;

- обработка ершами в горячем мыльном растворе;

- повторное многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;

- погружение в дистиллированную воду на 24 ч;

- сушка и стерилизация.

Контроль роста культуры. Лептоспиры размножаются в питательной среде, не изменяя ее внешнего вида. Среда остается прозрачной или слегка опалесцирующей в течение всего периода наблюдения. Поэтому для выявления роста лептоспир через 10 дней от момента посева из каждой пробирки или ампулы готовят "раздавленную каплю" и микроскопируют в темном поле.

При обнаружении лептоспир в пробирках их содержимое засевают по 0,5 мл (10 капель) в три пробирки с 5 мл свежей питательной среды в каждой. Посевы помещают в термостат на 7 - 10 дней при температуре 28 - 30 °C.

В случае получения хорошего роста (50 - 100 лептоспир в поле зрения при увеличении x 400) культуры используют как рабочие музейные штаммы (для последующей идентификации) и составляют на них паспорт.

Пробирки, где рост лептоспир не выявлен, вновь помещают в термостат и микроскопируют через каждые 10 дней. При отсутствии роста в течение трех месяцев посевы считают отрицательными.

Рост лептоспир в жидких питательных средах контролируют микроскопией, а также макроскопически - просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При осторожном встряхивании в питательной среде четко просматриваются опалесцирующие "муаровые" волны, образуемые выросшей культурой.

При выращивании клеток в пробирках с полужидкой средой (0,2% агара) на 1 - 3 см ниже ее поверхности образуются характерные плоские диски роста (феномен Дингера) или отдельные диффузно расположенные колонии. На 1%-ной агаровой среде в чашках Петри лептоспиры образуют субповерхностные колонии.

Штаммы хранят в соответствии с инструкцией хранения патогенных микробов при комнатной температуре и пересевают один раз в месяц.

Аналогичным способом контролируют рост культур диагностических штаммов, предназначенных для серологических исследований.

Хранение культур лептоспир. Штаммы лептоспир, постоянно поддерживаемые в лаборатории, можно хранить в пробирках под вазелиновым маслом или в запаянных ампулах. Лептоспиры консервируют после выращивания в сывороточной среде до максимального накопления. В пробирку на культуру наслаивают 0,25 мл или 5 капель стерильного вазелинового масла или культуру разливают в стерильные ампулы (1 - 5 мл) из нейтрального стекла и запаивают. Хранят пробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре. В таких условиях лептоспиры можно хранить без пересевов в течение шести месяцев. Для длительного хранения штаммов используют также полужидкие среды, содержащие 0,2% агара.

При необходимости длительного сохранения лептоспир их помещают в паровую (-168 °C) или жидкую фазу (-196 °C) жидкого азота. Предварительно культуру с добавленным стерильным глицерином в конечной концентрации 5 - 10% охлаждают со скоростью 35 или 60 об./мин. (от 0 до 130 °C).

Рабочие музейные штаммы можно хранить и при -70 °C. В этом случае нет необходимости добавлять глицерин в среду.

Дифференциация патогенных лептоспир от сапрофитных проводится по результатам биопробы и культурально-биохимическим тестам. Из них наиболее простыми являются выращивание культур при температуре 13 °C или в присутствии 8-азагуанина в концентрации 225 мкг/мл. В отличие от патогенных сапрофитные лептоспиры в этих условиях хорошо размножаются.

Биологический метод в диагностике лептоспирозов используется редко. Заражение животных подозрительным на наличие лептоспир материалом можно использовать с целью:

- выделения культур лептоспир из контаминированного посторонней микрофлорой материала (ткани органов, моча, вода открытых водоемов, почва и т.д.);

- очистки культур патогенных лептоспир от посторонней микрофлоры;

- определения вирулентности штаммов лептоспир;

- исследования воды открытых водоемов на наличие патогенных лептоспир.

Универсальной лабораторной модели для воспроизведения заболеваний различными сероварами лептоспир не существует.

Оптимальной моделью для воспроизведения иктерогеморрагического лептоспироза служат морские свинки массой 150 - 200 г, у которых заболевание протекает в первые дни с подъемом температуры до 40 - 41° и резким падением веса. На 5 - 10-й день после инфицирования высоковирулентным штаммом появляется желтушная окраска склер, видимых слизистых оболочек и кожи. Животные погибают через 12 - 48 ч после появления желтухи при явлении гипотермии. На вскрытии обнаруживается увеличение почек и геморрагии во внутренних органах, коже и подкожной клетчатке. Особенно типичны крупноточечные кровоизлияния в легочной ткани на общем ишемическом фоне ("крылья бабочки").

К лептоспирам других серологических групп морские свинки менее восприимчивы и чувствительны.

Более универсальная модель для воспроизведения экспериментального лептоспироза, вызванного возбудителями различных сероваров, - золотистые хомячки массой 25 - 40 г. Исследуемый материал вводят животным внутрибрюшинно, подкожно, внутривенно, через скарифицированную кожу и слизистые оболочки.

В случае появления клинической картины или гибели животных в острой фазе после аутопсии производят посев из внутренних органов (печени, почек). За животными, не погибшими в первые дни от инфекции, наблюдают в течение месяца. По истечении этого срока их умерщвляют (с учетом требований биоэтики) и производят посевы из коркового слоя почек; из сердца берут кровь (нативную или на фильтровальную бумагу) для исследования на наличие специфических антител с помощью реакции микроагглютинации лептоспир (РМА).

Исследование воды на наличие патогенных лептоспир. Золотистым хомячкам или молодым морским свинкам вводят внутрибрюшинно соответственно 1,0, 10 и 10 мл пробы. Предварительно пробы воды (50,0 мл) можно центрифугировать (в течение 20 мин. при 10000 об./мин.). Полученным осадком заражают животных (вводят 2 - 3 мл). Наблюдение за животными и исследование их органов на наличие лептоспир проводят, как описано выше. Ввиду отсутствия лабораторных животных, восприимчивых ко всем эпидемически значимым сероварам лептоспир, а также их низкой концентрации в пробах выделение возбудителей из воды открытых водоемов удается с трудом и требует больших затрат времени и средств. Отрицательные результаты исследования проб не являются основанием для исключения воды как фактора передачи возбудителя инфекции.

Серологические исследования - основа лабораторной диагностики лептоспирозов. В мировой практике "золотым стандартом" остается реакция микроагглютинации лептоспир (РМА), отличающаяся высокой чувствительностью и специфичностью. Кроме того, РМА позволяет определить серогруппу возбудителя, что важно для последующего проведения эпидобследования.

С целью серологического скрининга и ранней диагностики лептоспирозов используются также более простые тесты (реакция слайд-агглютинации, иммуноферментный анализ и др.) с родоспецифическими антигенами лептоспир.

Агглютинины в сыворотке крови больных лептоспирозом обнаруживаются в низких разведениях (1:20) начиная с 4-го, но чаще на 7 - 8-й день болезни. Титры антител достигают максимума, как правило, на 14 - 17-й день, а затем постепенно снижаются. Однако у некоторых больных, например при тяжелом клиническом течении лептоспирозной инфекции, особенно на фоне интенсивной антибиотикотерапии, наблюдается иммуносупрессия (серогенативные случаи) или отсроченный синтез специфических антител, которые появляются лишь спустя 2 - 3 месяца от начала болезни.

Это важное обстоятельство необходимо учитывать при оценке результатов лабораторной диагностики спорадических случаев лептоспирозов (особенно иктерогеморрагического), когда выявляются в основном клинически тяжелые случаи. Агглютинины в сыворотке крови переболевших лептоспирозом обнаруживаются в течение 3 - 5 лет и даже в более отдаленные сроки после перенесенного заболевания, что используется для ретроспективной диагностики и изучения иммунологической структуры населения.

В случаях спорадических заболеваний сыворотку больных необходимо исследовать в динамике не менее двух раз: первый - при поступлении больного в стационар (даже если это первый день болезни), второй - через 5 - 7 дней. При необходимости исследование можно повторить на 3 - 4 неделе болезни. Нарастание титров антител даже в невысоких разведениях (1-е отр. и 2-е - 1:20) является абсолютным доказательством наличия заболевания.

У больных с типичной клиникой лептоспироза, характерным эпиданамнезом, но отрицательными результатами серологического исследования его следует повторить перед выпиской из стационара, а иногда, особенно при наличии поздних осложнений, в процессе диспансерного наблюдения за реконвалесцентом в течение 3 - 6 месяцев.

При вспышке лептоспироза достаточно однократного исследования. При этом подтверждением лептоспирозной этиологии вспышки служит выявление у больных и переболевших антител в титрах от 1:100 и выше (соответственно срокам болезни).

Техника постановки РМА при лептоспирозе. Для постановки РМА используют живые культуры лептоспир 6 - 14-дневного возраста плотностью не менее 5 x 10(7) - 10(8) клеток/мл (50 - 100 лептоспир в поле зрения микроскопа при увеличении в x 400), с хорошей подвижностью клеток, без спонтанной агглютинации и посторонних примесей (осадок, контаминация посторонней микрофлорой). Каждую сыворотку исследуют со всеми референтными штаммами, представляющими серогруппы патогенных лептоспир, циркулирующих в данной местности. Для диагностики лептоспироза на территории Российской Федерации рекомендован стандартный набор диагностических штаммов лептоспир (табл. 2).

Таблица 2

НАБОР ЭТАЛОННЫХ ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР ДЛЯ РМА, РЕКОМЕНДУЕМЫЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА ЛЕПТОСПИРОЗ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

<*> Циркуляция лептоспир серовара hanka установлена только в природных очагах Приморского края, поэтому соответствующий штамм рекомендован для включения в диагностическую панель только на этой территории.

<**> В скобках указан отечественный аналог.

Международный набор референс-штаммов, рекомендуемый для использования в специализированных лабораториях лептоспирозов, дополнительно содержит штаммы серогрупп лептоспир, ранее не выделявшихся на территории России (табл. 3).

Таблица 3

МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАБОР РЕФЕРЕНС-ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РМА

При серологическом исследовании используют нативную сыворотку, консервированную (например, мертиолятом натрия в разведении 1:10000) или без консерванта. В РМА можно также исследовать пробы крови больных людей или животных, высушенные на фильтровальной бумаге. В этом случае кровь в количестве 2 капель (каждая размером 15 - 20 мм) наносят на фильтровальную бумагу и высушивают на воздухе. Для постановки реакции эти участки фильтровальной бумаги вырезают, разрезают и опускают на дно пробирки. В пробирку добавляют 10 капель физиологического раствора и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Полученный раствор служит основным разведением 1:10, из которого готовят последующие разведения. Исследовать сухие капли необходимо в срок, не превышающий одного месяца с момента взятия крови, при условии хранения их при комнатной температуре, и в течение 6 месяцев - в запаянном полиэтиленовом пакете в холодильнике при 4 °C.

Для постановки РМА сыворотку больного исследуют одновременно в двух разведениях 1:10 и 1:100 (при смешивании с культурой 1:20 - 1:200), чтобы исключить феномен прозоны. В случае положительной реакции определяют конечный титр сыворотки.

При вскрытии трупов грызунов кровь забирают из сердца с помощью пастеровской пипетки. Сыворотки грызунов исследуют сначала в одном разведении 1:10 (с культурой 1:20) и титруют с двукратным шагом, если реакция положительная.

Разведенная сыворотка и живая культура лептоспир из диагностического набора штаммов смешиваются в равных объемах (по 0,1 мл) в лунках полистироловых планшет.

В качестве контроля используют смесь равных объемов физиологического раствора и культуры лептоспир. Планшеты встряхивают и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре, после чего проводят окончательный учет реакции в препаратах "раздавленная капля" под микроскопом в темном поле зрения (при увеличении x 200 или x 400). Вследствие добавления к испытуемой сыворотке равного объема живой культуры лептоспир разведение сыворотки удваивается.

При массовых серологических исследованиях, особенно сывороток животных, РМА удобно ставить на предметном стекле, на котором смешивают по 1 капле разведенной сыворотки и культуры диагностических штаммов лептоспир.

Смесь накрывают покровным стеклом и после 15-минутной экспозиции при комнатной температуре проводят учет реакции под микроскопом. На каждом стекле можно поставить три реакции.

Агглютинация проявляется в форме склеивания лептоспир и образования своеобразных конгломератов в виде "паучков", "бантиков", "кос".

Учет реакции проводят визуально по условной системе оценок трех крестов.

Контроль: агглютинация отсутствует, все клетки лептоспир находятся в свободном состоянии;

+ - примерно 1/3 лептоспир (по сравнению с контролем) агглютинированы;

++ - от 1/3 до 2/3 лептоспир агглютинированы;

+++ - агглютинированы почти все или все лептоспиры.

При исследовании сывороток крови больных и переболевших людей и анализе результатов серологических исследований примерно в 60% испытуемых образцов, особенно на 1 - 2 неделе заболевания, наблюдаются межгрупповые реакции, затрудняющие установление этиологического агента.

Например, исследуемая сыворотка больного агглютинировала штамм М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до разведения 1:200, штамм Pomona (серогруппа Pomona) до 1:1600 и штамм Perepelicin (серогруппа Tarassovi) до 1:100. Следует заключить: лептоспироз, обусловленный возбудителем серогруппы Pomona. Если же сыворотки больных реагируют только с одним из диагностических штаммов, также ставят серогрупповой диагноз. Например, в сыворотке больного обнаруживают антитела к штамму Moskva V в разведении 1:800. Диагноз: лептоспироз, вызванный лептоспирами серогруппы Grippotyphosa.

В ряде случаев в первые дни болезни титр антител к неспецифическому возбудителю превышает таковой к этиологическому агенту заболевания (парадоксальные реакции), но на более поздних сроках выявляются только специфические антитела к возбудителю болезни. Например, при лептоспирозе, вызываемом лептоспирами серогруппы Pomona, в первые дни болезни часто обнаруживаются антитела только к лептоспирам Australis, титр которых быстро снижается. Исследование парных сывороток помогает установить серогруппу возбудителя.

Для суждения об истинной роли той или иной серогруппы лептоспир в качестве этиологического агента у конкретного больного иногда прибегают к определению класса антител. При этом исходят из того, что антитела класса IgG отличаются большей специфичностью, чем IgM, и в 85% случаев реагируют только с гомологичным антигеном.

Реакция макроагглютинации на стекле (слайд-агглютинации).

Реакцию макроагглютинации (РА) на стекле используют для обнаружения антител к лептоспирам различных сероваров и серогрупп в сыворотке крови больных лептоспирозом, используя родоспецифические антигены (например, БАСА). Обычно РА используется для предварительного тестирования сывороток больных с подозрением на лептоспирозную инфекцию и массового скрининга. Техника постановки реакции проста, поэтому она может быть использована в лабораториях любого уровня оснащенности, в т.ч. и в клинических.

Постановка реакции.

1. На чистое предметное стекло автоматической пипеткой наносят 10 мкл испытуемой сыворотки, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:1, и 10 мкл слайд-антигена (после встряхивания виалы). Сыворотку и антиген смешивают бактериологической петлей.

2. Спустя 2 - 4 мин. в проходящем свете осветителя ОИ-19 или с помощью вогнутого зеркала проводят оценку реакции: при положительном результате наблюдается образование четко видимых агглютинатов при одновременном просветлении реакционной смеси.

3. Если реакция агглютинации на стекле положительна или сомнительна, то сыворотку рекомендуется исследовать дополнительно в РМА.

Контроли.

1. Положительная контрольная сыворотка, которая дает четкую агглютинацию со слайд-антигеном в реакции макроагглютинации при постановке указанным методом.

2. Контроль антигена - слайд-антиген смешивается с физиологическим раствором в указанных выше соотношениях.

Примечание. Испытуемые сыворотки должны быть свободны от контаминации и консервантов. Инактивация сывороток не обязательна.

Выделенные на местах штаммы лептоспир идентифицируются до серогруппы с помощью набора диагностических агглютинирующих сывороток.

Идентификацию выделенных штаммов проводят с помощью перекрестной РМА. Для этого необходимо располагать гипериммунными специфическими сыворотками против испытуемого и эталонных штаммов лептоспир. Их перечень соответствует списку диагностических штаммов.

Штаммы относят к одной серогруппе, если титры РМА изучаемого штамма с референс-антисывороткой и референс-штамма с антисывороткой к изучаемому штамму превышают 10%. Серогруппы не имеют официального таксономического статуса. Поэтому следующим этапом идентификации является определение серовара лептоспир (основной таксон).

После выяснения серогрупповой принадлежности штамма исследования проводят в перекрестной РМА, но уже со штаммами, представляющими все серовары серогруппы, к которой выделенный штамм проявил наибольшее сродство.

Эталонные штаммы и антисыворотки к ним, прореагировавшие хотя бы с одной стороны на 10% и более, отбирают для сравнения их с опытным штаммом в перекрестных реакциях абсорбции.

Идентификацию штаммов лептоспир на уровне серогруппы, серовара и субсеровара можно проводить также в РМА с панелями моноклональных антител.

Генетические методы видовой и внутривидовой идентификации лептоспир пока находятся в стадии разработки и не могут быть рекомендованы для практического использования.

В связи с тем, что методы внутривидовой идентификации лептоспир достаточно сложны и трудоемки, выделенные от людей животных или объектов внешней среды изоляты следует направлять для идентификации в Сотрудничающий Центр ВОЗ и Минздрава России по лептоспирозам (на базе лаборатории лептоспирозов ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).