Законодательная база Российской Федерации

"ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЮДЕЙ ЛЕПТОСПИРОЗАМИ. 3.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 3.1.1128-02" (утв. Главным государственным санитарным врачом 03.07.2002)

Серологические исследования - основа лабораторной диагностики лептоспирозов. В мировой практике "золотым стандартом" остается реакция микроагглютинации лептоспир (РМА), отличающаяся высокой чувствительностью и специфичностью. Кроме того, РМА позволяет определить серогруппу возбудителя, что важно для последующего проведения эпидобследования.

С целью серологического скрининга и ранней диагностики лептоспирозов используются также более простые тесты (реакция слайд-агглютинации, иммуноферментный анализ и др.) с родоспецифическими антигенами лептоспир.

Агглютинины в сыворотке крови больных лептоспирозом обнаруживаются в низких разведениях (1:20) начиная с 4-го, но чаще на 7 - 8-й день болезни. Титры антител достигают максимума, как правило, на 14 - 17-й день, а затем постепенно снижаются. Однако у некоторых больных, например при тяжелом клиническом течении лептоспирозной инфекции, особенно на фоне интенсивной антибиотикотерапии, наблюдается иммуносупрессия (серогенативные случаи) или отсроченный синтез специфических антител, которые появляются лишь спустя 2 - 3 месяца от начала болезни.

Это важное обстоятельство необходимо учитывать при оценке результатов лабораторной диагностики спорадических случаев лептоспирозов (особенно иктерогеморрагического), когда выявляются в основном клинически тяжелые случаи. Агглютинины в сыворотке крови переболевших лептоспирозом обнаруживаются в течение 3 - 5 лет и даже в более отдаленные сроки после перенесенного заболевания, что используется для ретроспективной диагностики и изучения иммунологической структуры населения.

В случаях спорадических заболеваний сыворотку больных необходимо исследовать в динамике не менее двух раз: первый - при поступлении больного в стационар (даже если это первый день болезни), второй - через 5 - 7 дней. При необходимости исследование можно повторить на 3 - 4 неделе болезни. Нарастание титров антител даже в невысоких разведениях (1-е отр. и 2-е - 1:20) является абсолютным доказательством наличия заболевания.

У больных с типичной клиникой лептоспироза, характерным эпиданамнезом, но отрицательными результатами серологического исследования его следует повторить перед выпиской из стационара, а иногда, особенно при наличии поздних осложнений, в процессе диспансерного наблюдения за реконвалесцентом в течение 3 - 6 месяцев.

При вспышке лептоспироза достаточно однократного исследования. При этом подтверждением лептоспирозной этиологии вспышки служит выявление у больных и переболевших антител в титрах от 1:100 и выше (соответственно срокам болезни).

Техника постановки РМА при лептоспирозе. Для постановки РМА используют живые культуры лептоспир 6 - 14-дневного возраста плотностью не менее 5 x 10(7) - 10(8) клеток/мл (50 - 100 лептоспир в поле зрения микроскопа при увеличении в x 400), с хорошей подвижностью клеток, без спонтанной агглютинации и посторонних примесей (осадок, контаминация посторонней микрофлорой). Каждую сыворотку исследуют со всеми референтными штаммами, представляющими серогруппы патогенных лептоспир, циркулирующих в данной местности. Для диагностики лептоспироза на территории Российской Федерации рекомендован стандартный набор диагностических штаммов лептоспир (табл. 2).

Таблица 2

НАБОР ЭТАЛОННЫХ ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР ДЛЯ РМА, РЕКОМЕНДУЕМЫЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА ЛЕПТОСПИРОЗ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

<*> Циркуляция лептоспир серовара hanka установлена только в природных очагах Приморского края, поэтому соответствующий штамм рекомендован для включения в диагностическую панель только на этой территории.

<**> В скобках указан отечественный аналог.

Международный набор референс-штаммов, рекомендуемый для использования в специализированных лабораториях лептоспирозов, дополнительно содержит штаммы серогрупп лептоспир, ранее не выделявшихся на территории России (табл. 3).

Таблица 3

МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАБОР РЕФЕРЕНС-ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РМА

При серологическом исследовании используют нативную сыворотку, консервированную (например, мертиолятом натрия в разведении 1:10000) или без консерванта. В РМА можно также исследовать пробы крови больных людей или животных, высушенные на фильтровальной бумаге. В этом случае кровь в количестве 2 капель (каждая размером 15 - 20 мм) наносят на фильтровальную бумагу и высушивают на воздухе. Для постановки реакции эти участки фильтровальной бумаги вырезают, разрезают и опускают на дно пробирки. В пробирку добавляют 10 капель физиологического раствора и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Полученный раствор служит основным разведением 1:10, из которого готовят последующие разведения. Исследовать сухие капли необходимо в срок, не превышающий одного месяца с момента взятия крови, при условии хранения их при комнатной температуре, и в течение 6 месяцев - в запаянном полиэтиленовом пакете в холодильнике при 4 °C.

Для постановки РМА сыворотку больного исследуют одновременно в двух разведениях 1:10 и 1:100 (при смешивании с культурой 1:20 - 1:200), чтобы исключить феномен прозоны. В случае положительной реакции определяют конечный титр сыворотки.

При вскрытии трупов грызунов кровь забирают из сердца с помощью пастеровской пипетки. Сыворотки грызунов исследуют сначала в одном разведении 1:10 (с культурой 1:20) и титруют с двукратным шагом, если реакция положительная.

Разведенная сыворотка и живая культура лептоспир из диагностического набора штаммов смешиваются в равных объемах (по 0,1 мл) в лунках полистироловых планшет.

В качестве контроля используют смесь равных объемов физиологического раствора и культуры лептоспир. Планшеты встряхивают и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре, после чего проводят окончательный учет реакции в препаратах "раздавленная капля" под микроскопом в темном поле зрения (при увеличении x 200 или x 400). Вследствие добавления к испытуемой сыворотке равного объема живой культуры лептоспир разведение сыворотки удваивается.

При массовых серологических исследованиях, особенно сывороток животных, РМА удобно ставить на предметном стекле, на котором смешивают по 1 капле разведенной сыворотки и культуры диагностических штаммов лептоспир.

Смесь накрывают покровным стеклом и после 15-минутной экспозиции при комнатной температуре проводят учет реакции под микроскопом. На каждом стекле можно поставить три реакции.

Агглютинация проявляется в форме склеивания лептоспир и образования своеобразных конгломератов в виде "паучков", "бантиков", "кос".

Учет реакции проводят визуально по условной системе оценок трех крестов.

Контроль: агглютинация отсутствует, все клетки лептоспир находятся в свободном состоянии;

+ - примерно 1/3 лептоспир (по сравнению с контролем) агглютинированы;

++ - от 1/3 до 2/3 лептоспир агглютинированы;

+++ - агглютинированы почти все или все лептоспиры.

При исследовании сывороток крови больных и переболевших людей и анализе результатов серологических исследований примерно в 60% испытуемых образцов, особенно на 1 - 2 неделе заболевания, наблюдаются межгрупповые реакции, затрудняющие установление этиологического агента.

Например, исследуемая сыворотка больного агглютинировала штамм М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до разведения 1:200, штамм Pomona (серогруппа Pomona) до 1:1600 и штамм Perepelicin (серогруппа Tarassovi) до 1:100. Следует заключить: лептоспироз, обусловленный возбудителем серогруппы Pomona. Если же сыворотки больных реагируют только с одним из диагностических штаммов, также ставят серогрупповой диагноз. Например, в сыворотке больного обнаруживают антитела к штамму Moskva V в разведении 1:800. Диагноз: лептоспироз, вызванный лептоспирами серогруппы Grippotyphosa.

В ряде случаев в первые дни болезни титр антител к неспецифическому возбудителю превышает таковой к этиологическому агенту заболевания (парадоксальные реакции), но на более поздних сроках выявляются только специфические антитела к возбудителю болезни. Например, при лептоспирозе, вызываемом лептоспирами серогруппы Pomona, в первые дни болезни часто обнаруживаются антитела только к лептоспирам Australis, титр которых быстро снижается. Исследование парных сывороток помогает установить серогруппу возбудителя.

Для суждения об истинной роли той или иной серогруппы лептоспир в качестве этиологического агента у конкретного больного иногда прибегают к определению класса антител. При этом исходят из того, что антитела класса IgG отличаются большей специфичностью, чем IgM, и в 85% случаев реагируют только с гомологичным антигеном.

Реакция макроагглютинации на стекле (слайд-агглютинации).

Реакцию макроагглютинации (РА) на стекле используют для обнаружения антител к лептоспирам различных сероваров и серогрупп в сыворотке крови больных лептоспирозом, используя родоспецифические антигены (например, БАСА). Обычно РА используется для предварительного тестирования сывороток больных с подозрением на лептоспирозную инфекцию и массового скрининга. Техника постановки реакции проста, поэтому она может быть использована в лабораториях любого уровня оснащенности, в т.ч. и в клинических.

Постановка реакции.

1. На чистое предметное стекло автоматической пипеткой наносят 10 мкл испытуемой сыворотки, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:1, и 10 мкл слайд-антигена (после встряхивания виалы). Сыворотку и антиген смешивают бактериологической петлей.

2. Спустя 2 - 4 мин. в проходящем свете осветителя ОИ-19 или с помощью вогнутого зеркала проводят оценку реакции: при положительном результате наблюдается образование четко видимых агглютинатов при одновременном просветлении реакционной смеси.

3. Если реакция агглютинации на стекле положительна или сомнительна, то сыворотку рекомендуется исследовать дополнительно в РМА.

Контроли.

1. Положительная контрольная сыворотка, которая дает четкую агглютинацию со слайд-антигеном в реакции макроагглютинации при постановке указанным методом.

2. Контроль антигена - слайд-антиген смешивается с физиологическим раствором в указанных выше соотношениях.

Примечание. Испытуемые сыворотки должны быть свободны от контаминации и консервантов. Инактивация сывороток не обязательна.