Законодательная база Российской Федерации

"ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЮДЕЙ ЛЕПТОСПИРОЗАМИ. 3.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 3.1.1128-02" (утв. Главным государственным санитарным врачом 03.07.2002)

Принцип метода. В основе метода ПЦР лежит многократное копирование (амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени, который является маркерным для данного вида. Такое копирование осуществляется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой в присутствии дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (дНТФ) и синтетических олигонуклеотидных затравок синтеза ДНК, называемых праймерами. Праймеры комплементарны концевым последовательностям ДНК специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента

n по формуле 2 , где n - число циклов амплификации.

Каждый цикл состоит из трех этапов, каждому из которых соответствует определенный температурный режим.

1) Расплетение двойной спирали ДНК (денатурация ДНК) происходит при 93 - 95 °C.

2) Присоединение (отжиг) праймеров происходит комплементарно при температуре, специфической для данной пары праймеров.

3) Синтез новых цепей ДНК протекает при 72 °C путем удлинения праймера в направлении 5' - 3'. В результате 30 - 35 циклов амплификации синтезируется 10 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном геле.

Необходимое оборудование и реактивы

1. Микропипетки полуавтоматические на 1 - 10, 5 - 40, 40 - 200, 200 - 1000 мкл.

2. Микроцентрифуга на 8 - 12 тыс. об./мин. для пробирок объемом 1,5 и 0,5 мл.

3. Прибор для горизонтального электрофореза.

4. Программируемый термостат (ДНК-амплификатор).

5. Термостат на 45 - 55 °C для пробирок объемом 1,5 мл.

6. Ультрафиолетовый трансиллюминатор.

7. СВЧ-печь или водяная баня на 95 - 100 °C.

8. Встряхиватель для микропробирок (типа "Вортекс").

9. Тест-системы для определения ДНК Leptospira interrogans методом ПЦР.

Техника обработки клинического материала и проведения анализа изложены в инструкциях по применению амплификационных тест-систем фирмы-изготовителя.

В качестве исследуемого клинического материала используют кровь, сыворотку крови, СМЖ, мочу.

ПЦР-анализ характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью (от 10 до 1000 клеток в пробе) и высокой диагностической эффективностью на первой неделе заболевания (начиная с первых суток), даже на фоне антибиотикотерапии. Поэтому его можно рекомендовать как метод ранней экспресс-диагностики лептоспирозов. При тяжелом течении инфекции на фоне отсроченного синтеза специфических антител ПЦР может быть отнесена к методам выбора для быстрого лабораторного подтверждения клинического диагноза.

Вместе с тем отрицательный результат ПЦР-анализа не должен быть основанием для прекращения диагностического поиска, т.к. день начала болезни не всегда точно известен. Диагностическая чувствительность лабораторного анализа при лептоспирозах может быть значительно повышена за счет параллельного использования серологического теста (РМА) и ПЦР вне зависимости от фазы заболевания.