Законодательная база Российской Федерации

"ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЮДЕЙ ЛЕПТОСПИРОЗАМИ. 3.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 3.1.1128-02" (утв. Главным государственным санитарным врачом 03.07.2002)

Бактериологическим методом исследуют тот же материал и в те же сроки, что и при использовании метода микроскопии. Лептоспиры относятся к медленнорастущим микроорганизмам, поэтому выделение культуры имеет значение только для ретроспективного подтверждения клинического диагноза "лептоспироз" и более детальной расшифровки этиологии случая или вспышки.

Исследуемый материал от больного - кровь, мочу, СМЖ в количестве 5 капель засевают в 3 - 5 пробирок с питательной средой или стерильной дистиллированной водой, желательно у постели больного.

При посеве из органов трупа человека или павшего сельскохозяйственного животного (почек, печени) после вскрытия брюшной полости во избежание загрязнения посевов шпателем осторожно прижигают поверхность органа. Затем в этом месте производят прокол пастеровской пипеткой на глубину 0,25 - 0,50 см и забирают межтканевую жидкость с элементами ткани, которые с соблюдением всех правил асептики переносят в пробирку или ампулу с питательной средой.

Трупы грызунов в связи с быстрым развитием трупного обсеменения исследуют в первые часы (не позднее 12 ч в зависимости от температуры воздуха) после гибели зверька. Грызунов вскрывают при строгом соблюдении асептики. Шкурку зверька смачивают 5%-ной спиртовой настойкой йода. Стерильными инструментами производят вскрытие брюшной полости. Почку извлекают и помещают в стерильную чашку Петри. Затем небольшие кусочки ткани почки, взятые пастеровской пипеткой, засевают на питательную среду. Инструменты в процессе вскрытия обжигаются.

Посевы следует производить в несколько (3 - 5) пробирок или ампул со средой, которые затем помещают в термостат и культивируют при температуре 28 - 30 °C.

Для культивирования лептоспир используют жидкие сывороточные питательные среды, основным компонентом которых является сыворотка кролика или барана (Терских, Фервоорта-Вольфа и др.), а также полусинтетические твин-альбуминовые среды.

Среда Терских. Наиболее простой и оптимальной для практического использования является фосфатно-сывороточная среда Терских. Для приготовления 1 л основы этой среды к 100 мл фосфатного буфера (pH = 7,2) добавляют 900 мл дистиллированной воды. Основу дважды фильтруют через двуслойный бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют в автоклаве при 120 °C в течение 20 мин.; пробирки с выпавшим после автоклавирования кристаллическим или аморфным осадком выбраковывают.

В серии пробирок с прозрачным содержимым выборочно проверяют pH. Для посевов используют среду с pH 7,2 - 7,6. В каждую пробирку добавляют в стерильных условиях инактивированную в течение 30 мин. при температуре 56 °C нормальную кроличью сыворотку в количестве 0,5 мл (10 капель на 5 мл среды). Приготовленная питательная среда может быть использована только после 2-кратного прогревания в водяной бане при 56 °C в течение 1 ч. После каждого прогревания среда контролируется на стерильность (при 37 °C в течение суток).

В основу среды Фервоорта-Вольфа помимо компонентов, входящих в среду Терских, добавляют пептон (1 г на 1 л основы) и NaCl (0,5 г на 1 л основы).

Твин-альбуминовая среда.

Основные растворы. Растворяют следующие ингредиенты (в 100 мл дистиллированной воды каждый): NH4Cl - 25 г; ZnSO4 x 7H2O - 0,4 г; MgCl2 x 6H2O и CaCl2 x 2H2O по 1,5 г каждый; FeSO4 x 7H2O - 0,5 г; пируват натрия - 10,0 г; глицерин - 10,0 г; твин-80 - 10,0 г; тиамин HCl - 0,5 г и цианкобаламин - 0,02 г. Раствор FeSO4 должен быть свежеприготовленным и прозрачным.

Растворяют 10 г бычьего сывороточного альбумина (V фракция) в 50 мл дистиллированной воды, размешивают на магнитной мешалке, добавляя следующие растворы: CaCl2 - MgCl2 - 1 мл; FeSO4 - 10 мл; цианкобаламин - 1 мл; твин-80 - 12,5 мл. Доводят PH до 7,4 и добавляют дистиллированную воду до конечного объема 100 мл. Альбуминовую добавку стерилизуют фильтрацией.

Для приготовления основы среды к 996 мл дистиллированной воды добавляют: Na2HPO4 (обезвоженный) - 1 г; K2HPO4 (обезвоженный) - 0,3 г и NaCl - 1 г. Затем добавляют следующие растворы: NH4Cl - 1 мл; тиамин - 1 мл; пируват натрия - 1,0 мл и глицерин - 1 мл. PH основы среды доводят до 7,4, а затем стерилизуют автоклавированием при 121 °C в течение 20 мин.

Для приготовления жидкой твин-альбуминовой среды 1 объем альбуминовой добавки смешивают с 9 объемами основы среды при соблюдении асептики.

Селективные среды. В качестве селективных могут быть использованы все перечисленные выше жидкие питательные среды после добавления в них 5-фторурацила в концентрации 100 мкг/мл.

Обработка посуды. При культивировании лептоспир следует пользоваться посудой из нейтрального или химического стекла. Обработка новой или бывшей в употреблении посуды производится в посудомоечной машине с использованием специальных детергентов или ручным способом. Процесс ручной обработки пробирок состоит из следующих этапов:

- погружение на 24 ч в 1 - 2%-ный раствор соляной кислоты;

- многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;

- обработка ершами в горячем мыльном растворе;

- повторное многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;

- погружение в дистиллированную воду на 24 ч;

- сушка и стерилизация.

Контроль роста культуры. Лептоспиры размножаются в питательной среде, не изменяя ее внешнего вида. Среда остается прозрачной или слегка опалесцирующей в течение всего периода наблюдения. Поэтому для выявления роста лептоспир через 10 дней от момента посева из каждой пробирки или ампулы готовят "раздавленную каплю" и микроскопируют в темном поле.

При обнаружении лептоспир в пробирках их содержимое засевают по 0,5 мл (10 капель) в три пробирки с 5 мл свежей питательной среды в каждой. Посевы помещают в термостат на 7 - 10 дней при температуре 28 - 30 °C.

В случае получения хорошего роста (50 - 100 лептоспир в поле зрения при увеличении x 400) культуры используют как рабочие музейные штаммы (для последующей идентификации) и составляют на них паспорт.

Пробирки, где рост лептоспир не выявлен, вновь помещают в термостат и микроскопируют через каждые 10 дней. При отсутствии роста в течение трех месяцев посевы считают отрицательными.

Рост лептоспир в жидких питательных средах контролируют микроскопией, а также макроскопически - просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При осторожном встряхивании в питательной среде четко просматриваются опалесцирующие "муаровые" волны, образуемые выросшей культурой.

При выращивании клеток в пробирках с полужидкой средой (0,2% агара) на 1 - 3 см ниже ее поверхности образуются характерные плоские диски роста (феномен Дингера) или отдельные диффузно расположенные колонии. На 1%-ной агаровой среде в чашках Петри лептоспиры образуют субповерхностные колонии.

Штаммы хранят в соответствии с инструкцией хранения патогенных микробов при комнатной температуре и пересевают один раз в месяц.

Аналогичным способом контролируют рост культур диагностических штаммов, предназначенных для серологических исследований.

Хранение культур лептоспир. Штаммы лептоспир, постоянно поддерживаемые в лаборатории, можно хранить в пробирках под вазелиновым маслом или в запаянных ампулах. Лептоспиры консервируют после выращивания в сывороточной среде до максимального накопления. В пробирку на культуру наслаивают 0,25 мл или 5 капель стерильного вазелинового масла или культуру разливают в стерильные ампулы (1 - 5 мл) из нейтрального стекла и запаивают. Хранят пробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре. В таких условиях лептоспиры можно хранить без пересевов в течение шести месяцев. Для длительного хранения штаммов используют также полужидкие среды, содержащие 0,2% агара.

При необходимости длительного сохранения лептоспир их помещают в паровую (-168 °C) или жидкую фазу (-196 °C) жидкого азота. Предварительно культуру с добавленным стерильным глицерином в конечной концентрации 5 - 10% охлаждают со скоростью 35 или 60 об./мин. (от 0 до 130 °C).

Рабочие музейные штаммы можно хранить и при -70 °C. В этом случае нет необходимости добавлять глицерин в среду.