Законодательная база Российской Федерации

"ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1057-01" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.2001)

Разведением для микробиологических исследований служит раствор или суспензия исследуемого образца, смешанные с девятикратным количеством жидкости для разведения - разбавителем.

Приготовление разведений необходимо:

- при исследовании загрязненных вод в целях снижения количества микроорганизмов на единицу объема, для обеспечения возможности наблюдения за их ростом или подсчетом колоний;

- для постановки исследований, требующих количественного учета используемых модельных микроорганизмов, например при количественной оценке качества питательных сред, мембранных фильтров и т.д.

Приемлемое для учета число микроорганизмов составляет:

- для метода подсчета колоний на чашках Петри (90 - 100 мм) - от 15 до 300;

- для учета колоний на фильтре (47 - 50 мм) - от 15 до 100 колоний;

- для учета колоний на фильтре (35 мм) - от 15 до 60 колоний.

Важным моментом в процедуре приготовления разведений является равномерность распределения внесенных микроорганизмов по объему разбавителя. Равномерность распределения достигается тщательным перемешиванием полученной смеси. Достичь более качественных результатов позволяет использование специальных приборов - встряхивателей.

В процессе приготовления разведений каждый образец с помощью прибора тщательно взбалтывают в течение 5 - 10 с. Частоту вращения подбирают так, чтобы жидкость, которая образует воронку, не доходила до края пробирки на 2 - 3 см.

В качестве разбавителей при приготовлении разведений используют:

Для приготовления разбавителя указанные компоненты растворяют в воде, при необходимости с подогреванием. Доводят pH так, чтобы после стерилизации он был равен 7,0 +/- 0,2 при 25 °C. Разливают разбавитель во флаконы. Стерилизуют при 121 °C в течение 20 мин. Помимо перечисленных выше разбавителей, для приготовления разведений исследуемой воды допускается применение стерильной водопроводной воды.

Разведения исследуемого образца воды следует готовить непосредственно перед анализом и использовать для инокуляции не позже 30 мин. с момента приготовления. В стерильные пробирки, количество которых соответствует выбранной степени разбавления исследуемой воды, асептически вносят по 9 мл разбавителя. В первую из пробирок, содержащих 9 мл разбавителя, не касаясь стенок пробирки и поверхности разбавителя, пипеткой вносят 1 мл хорошо перемешанной пробы воды, тщательно встряхивают или перемешивают пипетированием.

Приготовленное первое разведение (10 в ст.-1) содержит в 1 мл суспензии 0,1 мл исходного образца. В следующую (вторую) пробирку, также содержащую 9 мл разбавителя, не касаясь стенок пробирки и поверхности разбавителя, новой пипеткой вносят 1 мл хорошо перемешанного первого разведения исследуемой пробы. Смесь тщательно встряхивают или перемешивают пипетированием. Второе разведение (10 в ст.-2) в 1 мл суспензии содержит 0,01 мл исходного образца.

Процедуру приготовления разведений продолжают по описанной схеме до получения суспензии с необходимой концентрацией исходного образца.

Приготовление суспензий с заданной концентрацией клеток тестовых микроорганизмов осуществляют с использованием оптического стандарта мутности, соответствующего 0,9 - 1 млрд. микробных клеток/мл.

В стерильную стандартную пробирку, прилагаемую к стандарту, вносят 3 - 4 мл разбавителя. Агаровую культуру тестового микроорганизма петлей переносят в пробирку и растирают по внутренней поверхности пробирки, постепенно смешивая с содержащимся в ней разбавителем.

Возможно приготовление бактериальной взвеси методом смыва выросшей культуры со скошенного агара 5 мл разбавителя.

Полученную взвесь микроорганизмов интенсивно встряхивают, добиваясь полного и равномерного распределения клеток. Мутность полученной взвеси сравнивают с мутностью оптического стандарта, который также предварительно тщательно встряхивают.

При визуальном несоответствии мутности приготовленной суспензии стандарту ее доводят либо добавлением агаровой культуры, либо добавлением разбавителя. После каждого вносимого изменения суспензию тщательно встряхивают.

При совпадении мутности приготовленной суспензии и мутности оптического стандарта считается, что концентрация клеток тестовой культуры в данной суспензии примерно соответствует значению, указанному для данного стандарта (0,9 - 1 x 10 в ст.9 кл/мл).

Для получения суспензии с нужной концентрацией тестового микроорганизма выполняют серийные разведения полученной стандартной суспензии описанным выше способом.

Для контроля правильности приготовления суспензии, правильности выполнения разведений и расчета заражающей дозы проводят контрольный высев. Выполнение контроля разведений и расчета заражающей дозы описаны в разделе 11.4.2.1.

Раздел составлен на основе:

ISO 6887-1983 "Общее руководство по приготовлению разведений для микробиологических исследований".