Законодательная база Российской Федерации

"ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1057-01" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.2001)

Идентификация должна проводиться только с чистой культурой. Проведение биохимической идентификации штаммов, выделенных на селективной питательной среде (Эндо или ее аналогах), предпочтительнее проводить с субкультурой, полученной на одной из неселективных питательных сред, не содержащих углеводов (ПА, ГРМ-агар, МПА). Постановка подтверждающих тестов всегда должна сопровождаться постановкой положительных и отрицательных контролей с эталонными культурами, ферментативная активность которых определена ранее.

Минимальное количество колоний, необходимое для идентификации, указано в нормативных документах на данный вид анализа.

Примечание (информационное). Достоверность количественного результата повышается с увеличением числа идентифицированных колоний.

В частности, ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов" при необходимости подтверждения характерных колоний требует отбирать не менее 5 изолированных колоний с пересевом для дальнейшей идентификации на неселективную питательную среду.

Французским комитетом по стандартизации АФНОР установлены следующие правила отбора достаточного количества колоний для подтверждения.

Если принять, что n - количество типичных колоний, а n - необходимое количество колоний, а n(1) - необходимое количество колоний для подтверждения, то:

(округленное до общего наивысшего количества).

Классический способ определения грам-принадлежности бактериальных клеток окраской по Граму с последующей микроскопией можно заменить простым и быстрым способом, не требующим оптики, - тестом Грегерсена.

Исследования проводят со свежими культурами. Бактериальную массу, взятую с плотной среды, в течение нескольких секунд эмульгируют на предметном стекле в капле 3%-ного водного раствора КОН. Образование слизи, тянущейся за петлей, указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательным микроорганизмам. Грамположительные микроорганизмы в этой реакции слизь не образуют.

Используют реактивы, рекомендованные в МУК 4.2.1018-01. Предпочтительно пользоваться готовыми индикаторными системами, изготовленными промышленным способом (например, СИБ-оксидазы, диски оксидазы производства LACHEMA, MERCK, DIFCO).

Надежный результат оксидазного теста может быть получен только при использовании суточной культуры, выращенной на неселективном питательном агаре. Следует иметь в виду, что при постановке оксидазного теста путем наложения мембранного фильтра с выросшими колониями на оксидазный реактив, постановки реакции с колонией, выращенной на среде Эндо, типичные темно-красные колонии могут давать нечеткую реакцию.

Каждый раз при постановке теста (серии тестов) проводят контрольные испытания с тест-культурами микроорганизмов, дающих положительную (Pseudomonas aeruginosa) и отрицательную (Е.coli) реакции.

Для постановки реакции используют пастеровскую пипетку или проверенную бактериологическую петлю, не давшую ложных реакций в указанном тесте при испытании с контрольными культурами.

Исследуемую колонию пересевают на скошенный питательный агар. Инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов. Оксидазный диск слегка смачивают дистиллированной водой / пропитывают реактивом фильтровальную бумагу. Делают мазок культуры на диске с реактивом. Появление окраски не позднее чем через 10 секунд рассматривается как положительная реакция.

При использовании коммерческих тест-систем процедура определения выполняется согласно инструкции.

Предпочтительно исследовать 18 - 24-часовую субкультуру, полученную на питательном агаре. Для контроля используются жидкие или полужидкие среды, проверенные ранее, как указано в разделе 11. Посев исследуемого штамма осуществляют в среды с углеводами по общепринятым методикам. Постановка положительного и отрицательного контроля осуществляется, как указано в пункте 11.5.3. Инкубацию посевов проводят согласно методической документации.

Оценку результатов проводят по окончании срока инкубации путем сравнения изменений в исследуемом посеве с изменениями в положительном контроле. Обязательным условием является отсутствие изменений отрицательного контроля.

Раздел составлен на основе:

ГОСТа 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов";

стандарта АФНОР NF Т 90-416, 1985;

Методических рекомендаций "Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)": МЗ СССР. М., 1984;

ГОСТа 18963-73 "Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа". М., 1973;

XI Государственной фармакопеи СССР. М., 1998; ИСО 7218-96;

Инструкции к ОКСИ-тест(у), ЛАХЕМА, Чешская Республика;

Определителя бактерий Берджи / Под ред. Дж Хоулта, Н. Кинга, П. Спита, Дж. Стейли и С. Уилльямса. М.: "Мир", 1997.