Законодательная база Российской Федерации

"ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1057-01" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.2001)

В качестве эталонного штамма для проведения контроля культуры клеток хозяина при проведении анализа на колифаги используется РНК-содержащий фаг MS2.

Процесс ведения эталонного штамма колифага MS2 состоит из 2 функциональных блоков:

- восстановление лиофилизированной культуры;

- создание запасов эталонной культуры и культуры для целевого использования.

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированными культурами нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины.

Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят ~= 0,5 мл питательного бульона для регидратации.

Рабочую культуру E.coli К12 F+ Str-r, хранящуюся на полужидком агаре, засевают в пробирку с 10 мл питательного бульона. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C 18 - 24 часа.

После инкубации 0,1 мл полученной бульонной культуры повторно засевают в 3 - 4 пробирки с 10 мл питательного бульона и помещают в термостат при (37 +/- 1) °C. Через 2 часа инкубации в каждую пробирку вносят регидрированную культуру фага MS2, инкубацию продолжают до 18 - 24 часов. После инкубации в пробирки добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, интенсивно встряхивают и оставляют на ночь в холодильнике.

Пипеткой отбирают бульон над осевшим хлороформом и переносят в стерильные пробирки, добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, встряхивают и хранят в холодильнике.

Одну пробирку используют для целевого назначения в контроле чувствительности культуры E.coli К12 F+ Str-r к фагу согласно п. 10.4.3. Две другие служат запасом эталонного фага.

Активность полученной культуры определяется титром фага. Через год хранения титр фага может снизиться. В этой связи необходимо получить новую культуру или провести определение титра хранящегося фага.

Для определения титра фага выполняется серия десятикратных разведений хранящейся бульонной суспензии эталонного фага, как описано в разделе 9.

Бактериальную взвесь E.coli К12 F+ Str-r готовят по стандарту мутности, как указано в разделе 9, вносят в расплавленный и остуженный до температуры 45 - 49 °C питательный агар из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара.

По 1 мл каждого разведения эталонного фага вносят в чашки Петри и заливают приготовленной смесью питательного агара и E.coli К12 F+ Str-r. Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 24 часа. Пробирки с разведениями закупоривают резиновыми или силиконовыми пробками и хранят до получения результатов при температуре 4 - 8 °C.

После инкубации просчитывают количество бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которых отмечается рост 30 - 100 негативных колоний фага.

Для использования допускается культура с титром более 10(7) - 10(8).

При получении титра менее 10(7) фаг можно размножить. Для нарастания титра необходимо повторить описанную процедуру.

После выполнения работ с культурами фагов необходимо провести тщательную обработку помещения дезсредствами и обеззараживания ультрафиолетовым излучением.

Раздел составлен на основе:

бактериологического контроля питательных сред.

Методические рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемических станций и больниц. Хабаровск, 1979;

Методических рекомендаций к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980;

ФС 42-3588-98. Питательная среда для выделения сальмонелл сухая (висмут-сульфит агар), срок действия до 15.10.03;

сборника инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности медицинских иммунобиологических препаратов. Утв. Приказом МЗ СССР N 31 от 13.01.83;

Руководства по аккредитации для лабораторий, производящих микробиологическое тестирование;

ISO 10705-1:1995 "Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages";

ISO 10705-1:1995 "Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 2: Enumeration of somatic bacteriophages".