Законодательная база Российской Федерации

"ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1057-01" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.2001)

Выполнение количественного контроля должно осуществляться лабораторией, имеющей лицензию на работу с необходимыми патогенными микроорганизмами, аттестованной (аккредитованной) в этой области и располагающей персоналом соответствующей квалификации.

Для исследования следует использовать свежеприготовленные среды одной варки. Исследуемые и контрольные среды готовят согласно инструкции изготовителя.

Среды, предназначенные для прямого поверхностного посева, разливают в чашки Петри слоем не менее 2 мм и предварительно асептически подсушивают одним из следующих способов:

1. Перевернутые чашки Петри с открытыми крышками выдерживают в термостате или сушильном шкафу при температуре 25 - 50 °C до исчезновения капель влаги с поверхности агара. Не пересушивать!

2. Закрытые неперевернутые чашки Петри выдерживают в ламинарном боксе в течение ночи.

3. Чашки Петри с полуоткрытыми крышками помещают в ламинарный бокс на 30 мин.

В качестве неселективной среды при определении ингибирующих и дифференцирующих свойств контролируемой среды используют мясопептонный агар, питательный агар на основе гидролизата кильки, рыбной муки (ГРМ-агар) и их аналоги.

Для исследования необходимо использовать стерильный физиологический раствор, содержащий 0,1% (по массе) пептона. Это сводит до минимума воздействие разбавителя на микроорганизмы. При невозможности приготовления данного разбавителя допускается использование стерильного физиологического раствора без пептона.

За два дня до исследования тестовую культуру микроорганизма пересевают со среды хранения на скошенный питательный агар согласно п. 10.2.4. На следующий день из полученной агаровой культуры с использованием стандарта мутности готовят суспензию

тестового штамма в стерильном разбавителе с концентрацией 10(9) кл/мл и десятикратные серийные разведения (по 8 разведение включительно) согласно п. 9.

Для контроля разбавления из 6 и 7 разведения высевают по 0,1 мл (100 мкл) суспензии прямым поверхностным посевом на чашки с питательным агаром. Из каждого разведения делают по три таких посева. После высева пробирки с разведениями немедленно переносятся в холодильник. Чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

В день исследования для каждой серии посевов подсчитывают среднее число колоний, выросшее на трех чашках. При правильно выполненном разведении среднее количество колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового микроорганизма из 6-го разведения, должно составлять около 100 КОЕ. Соотношение полученных средних значений при посеве из 6 и 7 разведений должно быть близко к 10:1.

В случае, если концентрация микроорганизмов в разведениях значительно отклоняется от расчетной и (или) не соблюдена кратность разведения, данный инокулят тестового штамма не пригоден для дальнейшего использования. Подготовку инокулята необходимо повторить.

Для показателей, требующих определения количества внесенных микроорганизмов, рассчитывают посевную дозу. Посевная доза - объем конкретного разведения, содержащий необходимое для посева количество жизнеспособных клеток тестового микроорганизма. Расчет дозы выполняют, основываясь на ранее определенных концентрациях тестового микроорганизма в 6 и 7 разведениях, исходя из требований, что посев на одну чашку не должен превышать 50 - 100 микробных клеток. При правильно выполненном разведении посевная доза составляет 50 - 100 мкл суспензии из 6 разведения.

После расчета посевной дозы определяют необходимое количество повторов посевов (не менее 5) исходя из расчета, что суммарное количество колоний на всех чашках на одной среде должно составлять не менее 200 КОЕ.

Приготовленные суспензии можно использовать, если они были охлаждены сразу же после приготовления и произведения контрольных высевов и не хранились более 24 часов. Перед исследованием инокулят следует тщательно перемешивать, чтобы добиться однородности суспензии микроорганизмов.

Данный метод посева используется при количественном определении показателей ростовых и дифференцирующих свойств жидких и полужидких питательных сред. Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Посевную дозу суспензии асептически помещают при помощи пипетки в пробирку с исследуемой питательной средой и перемешивают. Инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Посевную дозу суспензии асептически помещают при помощи пипетки на поверхность заранее подготовленной питательной среды (п. 11.4.2.1). Стерильным шпателем культуру распределяют по поверхности питательного агара, чтобы добиться равномерного распределения инокулята. После впитывания инокулята чашки переворачивают и инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

При определении показателей чувствительности и скорости роста используют по 0,1 мл из 5, 6, 7 и 8 разведений для посева на плотные питательные среды и по 1,0 мл из 4, 5, 6, 7 - для посева в жидкие среды. Разведения готовят и контролируют, как указано в п. 11.4.2.1.

Посев каждой дозы инокулята выполняют не менее чем на 3 чашки или пробирки в соответствии с пунктом 11.4.2.2. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 часов. Визуальный учет скорости роста культуры в каждом взятом в опыт разведении микробной взвеси производят для плотных сред через 12 и 24, а для жидких - через 3, 6 и т.д. часов инкубации.

Чувствительностью среды считается наибольшее разведение исходной суспензии тестового штамма с исходной концентрацией около

9 10 КОЕ/мл, обеспечивающее формирование колоний на всех засеянных чашках или визуально видимый рост во всех пробирках с исследуемой средой.

Чувствительность среды должна соответствовать параметру, указанному изготовителем в паспорте данной среды. Если данный параметр изготовителем не указан, то чувствительность должна составлять не менее чем 0,1 мл суспензии из 6 разведения для плотных и 1 мл суспензии из 7 разведения для жидких питательных сред.

При отсутствии роста в одной пробирке или на одной чашке с посевом разведения, указанного в паспорте как чувствительность, опыт повторяется на удвоенном числе пробирок или чашек. Приемлемым считается наличие роста в 5 посевах оцениваемого разведения из 6. Если при повторном исследовании чувствительность среды не соответствует паспортному значению, то ее бракуют.

Скорость роста контрольной культуры - минимальное время инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечен отчетливый, видимый невооруженным глазом рост культуры во всех пробирках с жидкими питательными средами (помутнение, наличие пленки, изменение цвета среды) или формирование типичных, легко дифференцируемых колоний на чашках с плотной средой.

Скорость роста не должна превышать время инкубации, указанное в нормативных документах для исследований, в которых эта среда используется.

Результат заносят в протокол оценки питательной среды по биологическим показателям (Прилож. 8.2).

Для оценки дифференцирующих свойств сред используют два тестовых штамма, отличающихся по основному дифференцируемому признаку ферментации лактозы E.coli (Lac+ ) и Shigella sonnei (Lac- ).

Разведения тестовых штаммов готовят, как указано в п. 11.4.2.1. Посевная доза должна содержать 50 - 100 микробных клеток на чашку, рассчитанная по контрольному посеву.

Из разведений тестовых штаммов, содержащих исходя из контрольных посевов 500 - 1000 микробных клеток в 1 мл, готовят 3 смеси:

1. По 1 мл каждого штамма E.coli (Lac+ ) и Shigella sonnei (Lac- ).

2. По 1 мл штамма E.coli (Lac+ ) и разбавителя.

3. По 1 мл штамма Shigella sonnei (Lac- ) и разбавителя.

Приготовленные смеси тщательно перемешивают. Из каждой смеси в соответствии с рассчитанной посевной дозой (по 50 - 100 мкл) засевают поверхностным методом не менее чем на 3 чашки с исследуемой средой. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

По окончании инкубации учитывают выраженность дифференциальных признаков при росте колоний тестового микроорганизма

E.coli (Lac+ ), ферментирующего лактозу на исследуемой среде (характерный цвет колоний, среды), и их отсутствие в посевах тестового штамма Shigella sonnei (Lac- ), не обладающего способностью к ферментации лактозы.

Дифференцирующие свойства среды считают удовлетворительными, если она обеспечивает определенный в паспорте перечень признаков и степень их выраженности у тестового штамма, обладающего искомыми свойствами. Результат заносится в протокол оценки питательной среды по биологическим показателям (Прилож. 8.2).

Этот показатель позволяет выявить и оценить наличие и степень ингибирующего влияния исследуемой среды на E.coli по сравнению с контрольной средой. В качестве контрольной используют ранее проведенную неселективную среду.

Определение процента извлекаемости (% всхожести) особенно важно для сред, используемых в методах прямого количественного подсчета (прямой посев исследуемой воды на чашку или фильтр), где наличие даже относительного ингибирующего влияния среды на искомые микроорганизмы будет искажать результат и снижать чувствительность метода.

Готовят инокуляты для посева и осуществляют расчет посевной дозы, как указано в п. 11.4.2.1. Посев на контрольную и исследуемую среду выполняют прямым посевом согласно п. 11.4.2.2.

Чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

После инкубации подсчитывают количество колоний, выросших на каждой чашке. Общее количество колоний во всех повторах (не менее 5) на контрольной неселективной среде должно быть не менее 200. Вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на контрольной и исследуемой средах.

Процент извлекаемости рассчитывают по формуле:

- процент всхожести на исследуемой среде;

- среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на исследуемой среде;

- среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на контрольной среде.

Среда признается приемлемой при условии, что различие между средними значениями количества колоний на контрольной и исследуемой средах недостоверно. При этом, как правило, % извлекаемости (всхожести) составляет не менее 80%.

Расчет достоверности различий средних значений количества колоний, выросших на контрольной и исследуемой средах, приведен в Прилож. 10.

Результат заносится в протокол количественной оценки питательной среды по биологическим показателям (Прилож. 8.2).

В случае получения достоверного различия результатов исследование повторяют, удваивая количество повторов: не менее 10 чашек с общей численностью количества учитываемых колоний на неселективной среде не менее 400.

Для оценки ингибирующих свойств среды Эндо (и ее аналогов) по отношению к микробам-ассоциантам используют тестовый штамм Staphylococcus aureus.

Разведения тестового штамма готовят и контролируют, как указано в п. 11.4.2.1.

Взвесь штамма-ассоцианта из разведений 10(-1) (10(8) микробных клеток в мл) по 100 мкл засевают на 3 чашки Петри с испытуемой и контрольной (неингибиторной) средами. В качестве контрольной среды используется питательный агар. Через 24 - 48 часов инкубации при температуре (37 +/- 1) °C определяют число колоний, сформировавшихся на испытуемой и контрольной средах.

Ингибирующие свойства среды являются удовлетворительными, если в разведении 10(-1) отсутствует рост микроба-ассоцианта при наличии роста в контрольных посевах. Результат заносят в протокол оценки питательной среды (Прилож. 8.2).