Законодательная база Российской Федерации

"ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1057-01" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.2001)

В практике лабораторий, проводящих санитарно-бактериологический контроль воды, используются мембранные фильтры диаметром 47 или 35 мм и средним размером пор 0,45 мкм.

Мембранные фильтры применяются:

- в анализе на общие и термотолерантные колиформные микроорганизмы;

- в анализе на споры сульфитредуцирующих клостридий.

Качество используемых мембранных фильтров может оказать существенное влияние на результаты анализа. При этом качество мембранных фильтров одного производителя может меняться от партии к партии. При поступлении каждой новой партии фильтров, а также при необходимости принятия решения о возможности продления сроков годности осуществляется контроль эффективности мембранных фильтров.

При наличии в поступившей партии нескольких серий фильтров контроль проводится для каждой серии.

Фильтры, допущенные к проведению анализа, используются однократно. Повторное применение мембранных фильтров запрещается.

Эффективность мембранных фильтров определяется путем сравнения числа колоний микроорганизмов, выросших на полноценной питательной среде в результате прямого поверхностного посева суспензии культуры контрольного микроорганизма, и числа колоний, выросших на этой же среде в результате посева способом мембранной фильтрации.

Оценка эффективности мембранных фильтров осуществляется по показателю "процент извлекаемости". Мембранные фильтры считаются пригодными, если при посеве способом мембранной фильтрации вырастает не менее 80% от числа колоний, полученных при прямом посеве.

Отбор фильтров для контрольного исследования должен проводиться "слепым" методом, т.е. фильтры для контроля необходимо отбирать произвольно из разных упаковок анализируемой партии.

В качестве неселективной среды можно использовать мясопептонный агар, питательный агар на основе гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар) и их аналоги. Для выполнения исследования допускаются питательные среды, прошедшие контроль, как указано в разделе 11. Все используемые среды следует готовить из одной партии материалов и реактивов в одно и то же время. Готовую среду разливают в чашки Петри слоем толщиной не менее 2 мм. Чашки со средой, предназначенные для прямого поверхностного посева, предварительно асептически подсушивают одним из следующих способов:

1. Перевернутые чашки Петри с открытыми крышками выдерживают в термостате или сушильном шкафу при температуре 25 - 50 °C до исчезновения капель влаги с поверхности агара. Не пересушивать!

2. Закрытые неперевернутые чашки Петри выдерживают в ламинарном боксе в течение ночи.

3. Чашки Петри с полуоткрытыми крышками помещают в ламинарный бокс на 30 мин.

Исследуемые мембранные фильтры должны быть стерильными.

В качестве тестовой культуры используют штамм E.coli M17-02.

Для исследования необходимо использовать стерильный физиологический раствор, содержащий 0,1% (по массе) пептона. Это сводит до минимума воздействие разбавителя на микроорганизмы. При невозможности приготовления данного разбавителя допускается использование стерильного физиологического раствора без пептона.

За два дня до исследования тестовую культуру микроорганизма пересевают со среды хранения на скошенный питательный агар, как указано в п. 10.2.4. На следующий день из полученной агаровой культуры готовят суспензию тестового штамма в стерильном разбавителе с концентрацией 10(9) кл/мл. Суспензию и необходимые разведения готовят с использованием стандарта мутности согласно разделу 9. Из 6 и 7 разведения (~= 1000 и 100 кл/мл, соответственно) высевают по 0,1 мл суспензии прямым поверхностным посевом на чашки с питательным агаром. Из каждого разведения делают по три таких посева. Чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1)°C в течение 18 - 24 часов. После высева пробирки с разведениями немедленно переносятся в холодильник. Срок хранения суспензии в холодильнике до использования в основном исследовании не должен превышать 24 часов.

В день исследования для каждого разведения подсчитывают среднее число колоний, выросшее на 3 чашках, и исходя из полученных результатов рассчитывают посевную дозу. Посевная доза должна составлять от 25 до 100 КОЕ на чашку или фильтр для фильтров диаметром 47 мм и 25 - 60 КОЕ для фильтров диаметром 35 мм. При правильно выполненном разведении посевная доза, чаще всего, составляет 50 - 100 мкл суспензии из 6 разведения.

Выполняются параллельные посевы суспензии чистой культуры тестового микроорганизма способом мембранной фильтрации через исследуемые мембранные фильтры и прямым (поверхностным) способом.

Необходимо выполнить, как минимум, пять повторов посева каждым способом. Количество повторов должно быть достаточным для обеспечения суммарного значения числа колоний в прямом посеве - не менее 200 КОЕ.

Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Предварительно рассчитанную посевную дозу суспензии вносят в пробирки, содержащие 10 мл разбавителя. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Количество пробирок, содержащих посевную дозу тестового микроорганизма, должно соответствовать количеству предполагаемых посевов методом мембранной фильтрации (не менее 5). После подготовки посевного материала пробирку с разведением культуры тестового микроорганизма, из которой производился отбор посевных доз для посева фильтрацией, немедленно переносят в холодильник.

Фильтровальную установку готовят согласно общепринятым процедурам. Контроль стерильности фильтровальной установки проводят, как указано в п. 6.5. С помощью стерильного пинцета помещают мембранный фильтр на основание держателя фильтра. Присоединяют и при необходимости закрепляют фильтровальную воронку. При отключенном вакууме прибавляют 20 - 30 мл стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной воды. Содержимое пробирки, содержащей посевную дозу, тщательно перемешивают и асептически переносят в воронку, содержащую разбавитель.

Включают вакуум и отфильтровывают содержимое воронки. В пробирку, ранее содержащую суспензию, вносят 10 мл разбавителя, тщательно перемешивают и отфильтровывают, после чего дважды, при включенном вакууме, ополаскивают воронку 20 - 30 мл стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной воды. Вакуум отключают, снимают фильтровальную воронку и стерильным пинцетом мембранный фильтр переносят на чашку с питательной средой (п. 11.2). Между мембранным фильтром и поверхностью агара не должно быть пузырьков воздуха. Посевы инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

После инкубации, при условии стерильности фильтровальной установки, подсчитывают количество типичных колоний, выросших на каждом фильтре. Вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на фильтрах при посеве методом мембранной фильтрации. Результаты заносят в протокол (Прилож. 9).

Для прямого поверхностного посева используют материал из той же пробирки с разведением культуры тестового микроорганизма, из которой производился отбор посевных доз для посева фильтрацией.

Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Предварительно рассчитанную посевную дозу суспензии асептически помещают при помощи пипетки на поверхность питательной среды (п. 11.4.2.1). Выполняют не менее 5 повторов. Стерильным стеклянным шпателем культуру распределяют по поверхности питательного агара, чтобы добиться равномерного распределения инокулята. Чашки переворачивают и инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

Вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на чашках при прямом поверхностном посеве. Общее количество колоний во всех повторах должно быть не менее 200 КОЕ. Результаты заносят в протокол (Прилож. 9).

Для оценки исследуемых мембранных фильтров вычисляют процент извлекаемости (удержания) мембранных фильтров по формуле:

где:

И% - процент извлекаемости (удержания);

- среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на фильтрах при посеве методом мембранной фильтрации;

- среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на чашках при прямом поверхностном посеве.

Пригодными считаются мембранные фильтры, имеющие процент извлекаемости (удержания) >= 80%.

В случае получения менее 80% извлекаемости тестового микроорганизма исследования следует повторить с удвоенным количеством повторов (не менее 10), с суммарным учетом по контрольному прямому посеву не менее 400 КОЕ.

Описанная методика может быть использована для сравнительной оценки стабильности качества разных партий фильтров, поставляемых одним производителем, а также мембранных фильтров разных марок разных производителей.

В этих целях выполняются следующие процедуры:

- подготовительный этап по п. 12.2;

- посевы методом мембранных фильтров с каждым видом (серией) фильтров по п. 12.3.1;

- посев прямым поверхностным методом по п. 12.3.2;

- оценка по показателю "процент извлекаемости" по п. 12.3.3.

Проведение дальнейшего сравнения эффективности исследуемых фильтров, показавших приемлемый "процент извлекаемости" >= 80%, осуществляется путем оценки достоверности различия средних значений количества колоний, выросших на мембранных фильтрах разных партий. Достоверность различия средних значений количества колоний оценивают с использованием критерия Стьюдента для вероятности 95% (Прилож. 10).

Если исследованию подвергались различные партии эквивалентных фильтров, выпускаемых одним изготовителем, то полученные средние значения количества микроорганизмов для каждой партии фильтров не должны отличаться с вероятностью 95%.

При сравнении мембранных фильтров разных марок, типов или разных производителей выбирают мембранные фильтры, среднее число колоний которых превышает аналогичный показатель для других фильтров с достоверностью 95%.

Раздел составлен на основе:

международного стандарта ISO 7704-85 "Оценка мембранных фильтров, используемых для микробиологических анализов" ("Water quality. Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses").