Законодательная база Российской Федерации

"ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1057-01" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.2001)

Процесс ведения штаммов в данном варианте состоит из следующих блоков:

- восстановление и контроль лиофилизированной культуры;

- создание запаса эталонной культуры, хранение в условиях криоконсервации;

- создание запаса рабочей культуры;

- подготовка культуры для целевого использования;

- контроль видовых и паспортных свойств.

Данный вариант ведения эталонных культур обеспечивает оптимальные условия для накопления и длительного (3 - 5 лет) хранения эталонной культуры, предназначенной для создания и регулярного восполнения запаса рабочей культуры.

В отличие от широко распространенной методики ведения культур микроорганизмов, основанной на неограниченных последовательных (линейных) пересевах, данная схема ведения сводит до минимума количество пассажей эталонной культуры, проводимых от момента восстановления после лиофилизации до целевого использования. Такой подход позволяет сократить вероятность нежелательных мутаций, ведущих к потере эталонных свойств, или случайного загрязнения. Забракованная линия эталонной культуры может быть в любой момент заменена новой.

Графически оптимальный вариант культивирования и хранения эталонных бактериальных культур аэробов и факультативных анаэробов отражен на схеме и примерном календарном плане манипуляций в Прилож. 7.2, 7.3 <*>.

<*> Приложение 7.3 не приводится.

Восстановление и контроль лиофилизированной культуры проводят, как описано в п. 10.2.1.

Параллельно с постановкой контрольных тестов из пробирки со скошенным питательным агаром культуру засевают в 2 пробирки с питательным бульоном и инкубируют 18 - 24 часа при 37 °C.

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов, в пробирки с ночной культурой добавляют стерильный глицерин в количестве 1/10 от объема культуры. Содержимое тщательно перемешивают и вносят по 1 мл в промаркированные пластиковые криопробирки из расчета 4 - 5 пробирок на каждый планируемый год хранения. Криопробирки с запасом эталонной культуры устанавливают в криобокс (штатив для криопробирок) и закладывают на хранение при температуре (70 +/- 10) °C. Альтернативным вариантом является хранение в жидком азоте при наличии соответствующего оборудования.

Закладку запасов эталонной культуры на длительное хранение осуществляют единожды на весь период ее использования. Запасы эталонной культуры восполнению не подлежат.

Данный блок выполняет задачу накопителя биомассы эталонного штамма, что позволяет избежать необходимости восполнять запасы рабочей культуры за счет повторных пассажей эталонного штамма через питательные среды и удлиняет "срок службы" культуры, полученной из одной ампулы.

Температуру криопробирки из запасов эталонной культуры доводят до комнатной температуры. Содержимое аккуратно перемешивают, вносят в пробирку с 8 - 10 мл питательного бульона и инкубируют при 37 °C 18 - 20 часов. После инкубации из питательного бульона выполняют высев в две пробирки со скошенным питательным агаром. Для E.coli К12 F+ Str-r - на питательный агар, содержащий стрептомицин. Посевы инкубируют в термостате (18 - 24) часа при 37 °C. Оставшуюся бульонную культуру E.coli M17-02 используют для оценки степени диссоциации, как указано в пункте 10.4.1.

Один из посевов на скошенном питательном агаре используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма паспортным (типовым) свойствам. Второй посев используют для создания запасов рабочей культуры.

При несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам использование культуры не допускается. В этом случае необходимо разморозить еще одну емкость с эталонной культурой и подвергнуть ее аналогичному исследованию.

Если культура снова не прошла контроль, ее снимают с хранения и в дальнейшем не используют. Необходимо получить новую ампулу с эталонной культурой и начать процедуру ведения тестового штамма сначала.

При удовлетворительном прохождении тестов культуру из пробирки со скошенным питательным агаром засевают уколом в 3 - 6 пробирок с полужидким агаром из расчета 1 - 2 пробирки на месяц в зависимости от интенсивности работы лаборатории. Посев инкубируют 18 - 24 часа при 37 °C. Пробирки закрывают резиновыми или силиконовыми пробками и хранят при 4 - 8 °C.

Запасы рабочей культуры создают 1 раз в 3 месяца, используя для этой цели новую пробирку из запаса эталонной культуры. Повторное замораживание размороженной эталонной культуры запрещается. Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.

Подготовку культуры для целевого использования осуществляют, как описано в п. 10.2.4.