Законодательная база Российской Федерации

"ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1057-01" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.2001)

Ведение эталонных культур обеспечивает максимальное сохранение типовых свойств штаммов, что достигается соблюдением принципов их культивирования, контроля и хранения.

Основные принципы ведения эталонных бактериальных культур:

- эталонные штаммы следует получать из официально признанной коллекции микроорганизмов;

- количество пассажей тестового микроорганизма на питательных средах с момента его восстановления до момента его целевого использования должно быть, по возможности, минимальным;

- движение культуры с момента ее восстановления после лиофилизации до целевого использования должно быть однонаправленным, т.е. запасы эталонной культуры не должны пополняться за счет (из) запасов рабочей культуры. Нежелательно пополнять запасы рабочей культуры путем получения ее субкультур;

- контроль эталонного штамма на соответствие паспортным данным и отсутствие диссоциации необходимо проводить перед закладкой на длительное хранение и перед восполнением запасов рабочей культуры;

- штаммы с измененными свойствами для дальнейшей работы не используют;

- для целевого использования пригодны культуры эталонного штамма, прошедшие с момента высева со среды для хранения запасов рабочей культуры не более 2 пассажей.

Данный раздел регламентирует вопросы культивирования, хранения и контроля эталонных культур, которые должны использоваться для обеспечения надлежащего качества исследований в практике лабораторий, выполняющих санитарно-микробиологические исследования воды.

Согласно СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности", пункт 3.1.6: "Производственным подразделениям предприятий, контролирующим готовую продукцию, разрешается иметь только коллекцию типовых культур, предусмотренных нормативно-технической документацией".

В практике лабораторий, выполняющих санитарно-микробиологические исследования воды, используются следующие эталонные культуры микроорганизмов:

1. E.coli M17-02 как положительный контроль биохимических тестов и отрицательный контроль реактива на оксидазу; для контроля мембранных фильтров; для контроля качества питательных сред по биологическим показателям.

2. Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorescens как положительный контроль реактива на оксидазу.

3. E.coli К12 F+ Str-r для выполнения анализа на колифаги.

4. Фаг MS2 для контроля способности рабочей культуры E.coli К12 F+ Str-r лизироваться специфическим фагом.

Хранение культур осуществляется в соответствии с п. 3.2.12 СП 1.2.036-95. Лаборатория должна иметь разрешение на работу с микроорганизмами III - IV групп патогенности.

С учетом различной технической и материальной обеспеченности лабораторий возможны два варианта ведения эталонных бактериальных культур:

- без создания запаса эталонной культуры длительного хранения, не требующий специального оснащения;

- с созданием запаса эталонной культуры длительного хранения с применением криоконсервации, который следует рассматривать как оптимальный.

Процесс ведения эталонных культур в данном варианте состоит из следующих блоков:

- восстановление и контроль лиофилизированной культуры;

- создание запаса рабочей культуры; хранение в полужидком агаре при 4 - 8 °C;

- восполнение запаса рабочей культуры;

- подготовка культуры для целевого использования;

- контроль видовых и паспортных свойств.

Хранение запаса рабочей культуры в полужидком агаре при 4 - 8 °C не требует специального оснащения, но порождает необходимость восполнения запасов рабочей культуры путем получения ее субкультур на среде хранения каждые 3 месяца.

Дополнительные пассажи через питательные среды могут привести к диссоциации штамма и потере тестовых свойств. Восполнять запас рабочей культуры разрешается только 3 раза (конец 3, 6 и 9 месяца) с момента его создания. Это ограничивает срок использования эталонной культуры, полученной из 1 ампулы, 1 годом, по истечении которого необходимо вскрыть новую ампулу с тестовой культурой.

Данный вариант культивирования и хранения эталонных культур аэробов и факультативных анаэробов отражен на схеме в прилож. 7.1 <*>.

<*> Не приводится.

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят ~= 0,3 мл питательного бульона для регидратации. Содержимое ампулы перемешивают, переносят стерильной пастеровской пипеткой или шприцем в пробирку с питательным бульоном и инкубируют при 37 °C в течение 18 - 24 часов. Оставшуюся бульонную культуру Е.coli M17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма.

После инкубации из питательного бульона делают высев петлей на скошенный питательный агар в две пробирки. При восстановлении штамма E.coli К12 F+ Str-r посев осуществляется на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин. Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 24 часа.

Одну пробирку с посевом используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым паспортным свойствам. Второй посев на скошенном питательном агаре используют для создания запасов рабочей культуры.

Культура с измененными свойствами в работу не допускается.

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов культуру со скошенного питательного агара (для Е.coli К12 F+ Str-r - с питательного агара со стрептомицином) засевают уколом в столбик с полужидким агаром. В зависимости от интенсивности работы лаборатории посев проводят в 4 - 7 пробирок из расчета по 1 - 2 пробирки на 1 месяц работы и в 1 пробирку для восполнения запасов рабочей культуры через три месяца на следующий квартал. Посевы инкубируют 18 - 24 часа при 37 °C. При наличии роста пробирки закрывают резиновыми пробками и закладывают на хранение при температуре 4 - 8 °C.

Одну из пробирок с культурой, предназначенной для восполнения рабочих запасов, маркируют и хранят отдельно. Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.

Восполнение запасов рабочей культуры производится в конце третьего, шестого и девятого месяца с момента вскрытия ампулы (каждые 3 месяца).

Для восполнения запасов рабочей культуры используется субкультура на среде хранения, полученная ранее при создании запасов или при очередном их восполнении. Из пробирки с культурой, предназначенной для восполнения запасов, производят посев в питательный бульон. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 18 - 24 часов. Оставшуюся бульонную культуру Е.coli M17-02 используют для оценки степени диссоциации.

После инкубации из питательного бульона делают высев петлей в две пробирки со скошенным питательным агаром. При ведении штамма E.coli К12 F+ Str-r посев осуществляется на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин. Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 24 часа.

Один из посевов используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым паспортным свойствам. Второй посев на скошенном питательном агаре используют для восполнения запасов рабочей культуры.

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов процедура закладки культуры на хранение осуществляется согласно п. 10.2.2. Восполнение запасов рабочей культуры проводят только 3 раза. По истечении года использования необходимо получить новую эталонную культуру из коллекции микроорганизмов.

Накануне использования культуру с полужидкого агара высевают на 2 пробирки со скошенным питательным агаром. E.coli К12 F+ Str-r пересевают на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин. Посевы инкубируют 18 - 24 часа при 37 °C.

Культуру из одной пробирки используют по назначению с предварительной подготовкой согласно методическим документам. Вторая пробирка используется для получения культуры для работы на следующий (второй) день. При необходимости получения культуры тест-штамма на третий день высев снова производят с полужидкого агара.

Процесс ведения штаммов в данном варианте состоит из следующих блоков:

- восстановление и контроль лиофилизированной культуры;

- создание запаса эталонной культуры, хранение в условиях криоконсервации;

- создание запаса рабочей культуры;

- подготовка культуры для целевого использования;

- контроль видовых и паспортных свойств.

Данный вариант ведения эталонных культур обеспечивает оптимальные условия для накопления и длительного (3 - 5 лет) хранения эталонной культуры, предназначенной для создания и регулярного восполнения запаса рабочей культуры.

В отличие от широко распространенной методики ведения культур микроорганизмов, основанной на неограниченных последовательных (линейных) пересевах, данная схема ведения сводит до минимума количество пассажей эталонной культуры, проводимых от момента восстановления после лиофилизации до целевого использования. Такой подход позволяет сократить вероятность нежелательных мутаций, ведущих к потере эталонных свойств, или случайного загрязнения. Забракованная линия эталонной культуры может быть в любой момент заменена новой.

Графически оптимальный вариант культивирования и хранения эталонных бактериальных культур аэробов и факультативных анаэробов отражен на схеме и примерном календарном плане манипуляций в Прилож. 7.2, 7.3 <*>.

<*> Приложение 7.3 не приводится.

Восстановление и контроль лиофилизированной культуры проводят, как описано в п. 10.2.1.

Параллельно с постановкой контрольных тестов из пробирки со скошенным питательным агаром культуру засевают в 2 пробирки с питательным бульоном и инкубируют 18 - 24 часа при 37 °C.

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов, в пробирки с ночной культурой добавляют стерильный глицерин в количестве 1/10 от объема культуры. Содержимое тщательно перемешивают и вносят по 1 мл в промаркированные пластиковые криопробирки из расчета 4 - 5 пробирок на каждый планируемый год хранения. Криопробирки с запасом эталонной культуры устанавливают в криобокс (штатив для криопробирок) и закладывают на хранение при температуре (70 +/- 10) °C. Альтернативным вариантом является хранение в жидком азоте при наличии соответствующего оборудования.

Закладку запасов эталонной культуры на длительное хранение осуществляют единожды на весь период ее использования. Запасы эталонной культуры восполнению не подлежат.

Данный блок выполняет задачу накопителя биомассы эталонного штамма, что позволяет избежать необходимости восполнять запасы рабочей культуры за счет повторных пассажей эталонного штамма через питательные среды и удлиняет "срок службы" культуры, полученной из одной ампулы.

Температуру криопробирки из запасов эталонной культуры доводят до комнатной температуры. Содержимое аккуратно перемешивают, вносят в пробирку с 8 - 10 мл питательного бульона и инкубируют при 37 °C 18 - 20 часов. После инкубации из питательного бульона выполняют высев в две пробирки со скошенным питательным агаром. Для E.coli К12 F+ Str-r - на питательный агар, содержащий стрептомицин. Посевы инкубируют в термостате (18 - 24) часа при 37 °C. Оставшуюся бульонную культуру E.coli M17-02 используют для оценки степени диссоциации, как указано в пункте 10.4.1.

Один из посевов на скошенном питательном агаре используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма паспортным (типовым) свойствам. Второй посев используют для создания запасов рабочей культуры.

При несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам использование культуры не допускается. В этом случае необходимо разморозить еще одну емкость с эталонной культурой и подвергнуть ее аналогичному исследованию.

Если культура снова не прошла контроль, ее снимают с хранения и в дальнейшем не используют. Необходимо получить новую ампулу с эталонной культурой и начать процедуру ведения тестового штамма сначала.

При удовлетворительном прохождении тестов культуру из пробирки со скошенным питательным агаром засевают уколом в 3 - 6 пробирок с полужидким агаром из расчета 1 - 2 пробирки на месяц в зависимости от интенсивности работы лаборатории. Посев инкубируют 18 - 24 часа при 37 °C. Пробирки закрывают резиновыми или силиконовыми пробками и хранят при 4 - 8 °C.

Запасы рабочей культуры создают 1 раз в 3 месяца, используя для этой цели новую пробирку из запаса эталонной культуры. Повторное замораживание размороженной эталонной культуры запрещается. Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.

Подготовку культуры для целевого использования осуществляют, как описано в п. 10.2.4.

Постановка контроля включает:

- оценку степени диссоциации культуры Е.coli M17-02;

- проверку видовых свойств бактериальных культур;

- проверку способности E.coli К12 F+ Str-r лизироваться специфичным фагом MS2;

- проверку культуры E.coli К12 F+ Str-r на однородность и отсутствие загрязнения фагом.

Из 18-часовой бульонной культуры делают 10-кратные разведения физиологическим раствором. По 0,1 мл из 5 и 6 разведения засевают на 2 чашки питательного агара, предварительно подсушенные в термостате. Шпателем посевы распределяют по поверхности агара до полного исчезновения влаги и инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

Выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 100 колоний. Проверку тест-штаммов на диссоциацию производят путем визуального просмотра изолированных колоний на чашках в прямом и косонаправленном свете через бинокулярную лупу или микроскоп на малом увеличении.

На питательном агаре колонии бактерий вида Е.coli образуют колонии средней величины (3 - 5 мм), плоско-выпуклые, круглые, гладкие с ровным краем (S-форма), влажные, блестящие, прозрачные в прямом и непрозрачные (опалово-мутные) в косопроходящем свете. В косопроходящем свете колонии эшерихий могут иметь равномерную зернистость.

В R-форме колонии эшерихий более плоские, большего размера, неправильной формы с неровными краями и шероховатой матовой поверхностью.

При наличии диссоциации (по размеру, S-R-диссоциация, др.) подсчитывают количество измененных колоний и общее количество просмотренных колоний. Общее количество просмотренных бактерий не должно быть менее 30. Затем рассчитывают процент диссоциации по формуле:

Если процент диссоциированных колоний превышает 25%, то данная культура не пригодна для дальнейшего использования.

В связи с полиморфизмом колоний для штаммов Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens, а также E.coli К12 F+ Str-r оценка R-S-диссоциации не проводится.

После восстановления лиофилизированной культуры проводится типирование культуры по биохимическим свойствам до вида.

Идентификацию рекомендуется проводить с использованием тест-систем биохимической идентификации семейства Enterobacteriaceae, разрешенных к применению. При этом следует руководствоваться рекомендациями производителя. Правомочна постановка отдельных биохимических тестов.

Перед очередным ежеквартальным созданием запаса рабочей культуры оценку эталонного штамма E.coli проводят путем подтверждения следующих основных свойств:

- отсутствие оксидазной активности;

- грам-негативности;

- способности образовывать на среде Эндо характерные темно-красные (малиновые) колонии с металлическим блеском и отпечатком на среде;

- способности утилизировать лактозу до кислоты и газа при температуре 37 и 44 °C в течение 24 - 48 часов;

- способность утилизировать глюкозу до кислоты и газа при температуре 37 °C в течение 24 часов.

Если культура не соответствует видовым свойствам или выявлено наличие посторонних микроорганизмов, то она не пригодна для дальнейшего использования.

Способность E.coli К12 F+ Str-r лизироваться специфичным фагом, являющимся основополагающим свойством тест-культуры, на котором основан метод определения колифагов в воде.

Контроль чувствительности E.coli К12 F+ Str-r к фагу осуществляется каждый раз, когда из запасов хранения берется новая пробирка с рабочей культурой на полужидком агаре.

Бактериальную взвесь E.coli К12 F+ Str-r готовят по стандарту мутности, как указано в разделе 9. На 100 мл расплавленного и остуженного до 45 - 49 °C питательного агара вносят 1 мл бактериальной взвеси и разливают в чашки. После застывания чашки на поверхность агара наносят каплю (0,05 мл) суспензии фага (не захватывая хлороформа). Инкубируют при 37 °C 18 - 24 часа. Просмотр посевов следует осуществлять в проходящем свете.

Культура считается восприимчивой и пригодной для проведения анализов воды при наличии четких зон лизиса.

При отсутствии зон лизиса культура не пригодна для использования и подлежит замене.

Бактериальную взвесь E.coli К12 F+ Str-r готовят по стандарту мутности, как указано в разделе 9, вносят в расплавленный и остуженный до температуры 45 - 49 °C питательный агар из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Чашку Петри заливают приготовленной смесью, инкубируют при температуре 37 °C 18 - 24 часа.

Посевы просматривают в проходящем свете. Культура должна давать равномерный газон роста. Наличие зон лизиса в контроле свидетельствует о загрязненности культуры фагами.

Загрязненная культура не пригодна для дальнейшего использования.

Оценку эталонного штамма Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens проводят путем подтверждения следующих свойств:

- наличия оксидазной активности;

- грам-негативности;

- роста на ПБ в виде серебристой пленки на поверхности с образованием кольца сине-зеленого пигмента;

- наличия сине-зеленого пигмента пиоцианина при росте на ПА при 37 °C;

- способности роста на питательном агаре при 42 °C в течение 24 часов (для Pseudomonas aeruginosa);

- способности роста на питательном агаре при 4 °C в течение 24 часов (для Pseudomonas fluorescens) либо при температурном оптимуме, указанном в паспорте.

Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего использования.

В качестве эталонного штамма для проведения контроля культуры клеток хозяина при проведении анализа на колифаги используется РНК-содержащий фаг MS2.

Процесс ведения эталонного штамма колифага MS2 состоит из 2 функциональных блоков:

- восстановление лиофилизированной культуры;

- создание запасов эталонной культуры и культуры для целевого использования.

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированными культурами нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины.

Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят ~= 0,5 мл питательного бульона для регидратации.

Рабочую культуру E.coli К12 F+ Str-r, хранящуюся на полужидком агаре, засевают в пробирку с 10 мл питательного бульона. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C 18 - 24 часа.

После инкубации 0,1 мл полученной бульонной культуры повторно засевают в 3 - 4 пробирки с 10 мл питательного бульона и помещают в термостат при (37 +/- 1) °C. Через 2 часа инкубации в каждую пробирку вносят регидрированную культуру фага MS2, инкубацию продолжают до 18 - 24 часов. После инкубации в пробирки добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, интенсивно встряхивают и оставляют на ночь в холодильнике.

Пипеткой отбирают бульон над осевшим хлороформом и переносят в стерильные пробирки, добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, встряхивают и хранят в холодильнике.

Одну пробирку используют для целевого назначения в контроле чувствительности культуры E.coli К12 F+ Str-r к фагу согласно п. 10.4.3. Две другие служат запасом эталонного фага.

Активность полученной культуры определяется титром фага. Через год хранения титр фага может снизиться. В этой связи необходимо получить новую культуру или провести определение титра хранящегося фага.

Для определения титра фага выполняется серия десятикратных разведений хранящейся бульонной суспензии эталонного фага, как описано в разделе 9.

Бактериальную взвесь E.coli К12 F+ Str-r готовят по стандарту мутности, как указано в разделе 9, вносят в расплавленный и остуженный до температуры 45 - 49 °C питательный агар из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара.

По 1 мл каждого разведения эталонного фага вносят в чашки Петри и заливают приготовленной смесью питательного агара и E.coli К12 F+ Str-r. Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 24 часа. Пробирки с разведениями закупоривают резиновыми или силиконовыми пробками и хранят до получения результатов при температуре 4 - 8 °C.

После инкубации просчитывают количество бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которых отмечается рост 30 - 100 негативных колоний фага.

Для использования допускается культура с титром более 10(7) - 10(8).

При получении титра менее 10(7) фаг можно размножить. Для нарастания титра необходимо повторить описанную процедуру.

После выполнения работ с культурами фагов необходимо провести тщательную обработку помещения дезсредствами и обеззараживания ультрафиолетовым излучением.

Раздел составлен на основе:

бактериологического контроля питательных сред.

Методические рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемических станций и больниц. Хабаровск, 1979;

Методических рекомендаций к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980;

ФС 42-3588-98. Питательная среда для выделения сальмонелл сухая (висмут-сульфит агар), срок действия до 15.10.03;

сборника инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности медицинских иммунобиологических препаратов. Утв. Приказом МЗ СССР N 31 от 13.01.83;

Руководства по аккредитации для лабораторий, производящих микробиологическое тестирование;

ISO 10705-1:1995 "Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages";

ISO 10705-1:1995 "Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 2: Enumeration of somatic bacteriophages".