Законодательная база Российской Федерации

"ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1057-01" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.2001)

Основным методом концентрирования в санитарно-бактериологических исследованиях воды является фильтрование через мембранные фильтры. Введение дополнительного фактора, мембранного фильтра, в систему "микроорганизм - питательная среда" может оказать влияние на показатели роста микроорганизмов и биологические свойства среды.

В настоящее время ведущие зарубежные производители питательных сред выпускают среды, обеспечивающие своим составом оптимальные условия роста микроорганизмов при использовании мембранных фильтров и целенаправленно предназначенные для исследования воды мембранным методом. В отличие от своих аналогов для клинических исследований или прямых посевов воды без концентрирования эти среды имеют индекс m, например: m Endo agar.

В нашей стране подобные среды пока не производятся и в нормативных требованиях к качеству питательных сред такой важный момент, как комплексная оценка системы "микроорганизм - фильтр - среда", не нашел отражения.

Тем не менее, в случаях необходимости сделать выбор между средами, предлагаемыми разными производителями, оценка качества среды в комплексе с используемыми в анализе мембранными фильтрами, наряду с перечисленными в п. п. 11.1 - 11.4.2 исследованиями, будет способствовать повышению объективности получаемых результатов, а в отдельных случаях может стать определяющим фактором в принятии решения.

Однозначно признано, что исследования, выполненные на чистых культурах модельных микроорганизмов, не могут учесть влияния всего многообразия микроорганизмов естественных водоемов. В этой связи, при проведении сравнительной оценки дифференцирующих и ингибирующих свойств различных сред, может оказаться полезным использование природной воды для приближения к натурным условиям.

Однако при выполнении этих исследований необходимо всегда иметь в виду наличие индивидуальных особенностей каждого водоема, а также нестабильность во времени как микробиологических характеристик природных вод, так и уровней химического загрязнения. Эти факты существенно снижают важность полученных результатов и ограничивают их применение конкретным водоемом.

С учетом изложенного описанная методика носит рекомендательный характер.

Процент извлекаемости используемых мембранных фильтров должен составлять не менее 80% на полноценной неселективной среде. Мембранные фильтры должны быть стерильными.

Питательные среды для посева мембранных фильтров не подсушиваются, но на поверхности разлитых в чашки сред не должно быть видимой влаги.

Подготовку инокулята тестовых культур микроорганизма осуществляют, как указано в п. 11.4.2.1. В качестве тестовой культуры используют модельный штамм E.coli M17-02. Посевная доза на фильтр должна составлять от 25 до 100 КОЕ для фильтров диаметром 47 мм и 25 - 60 КОЕ для фильтров диаметром 35 мм.

Расчетное засеваемое общее количество тестовых микроорганизмов должно быть не менее 200, при количестве повторов - не менее 5.

Природная вода используется как естественный источник водных сапрофитов для оценки ингибирующих и дифференцирующих свойств исследуемых сред. За сутки до начала исследований природная вода, предназначенная для подготовки инокулята, должна быть оценена по общепринятым методикам на общее содержание микроорганизмов (ОМЧ) и наличие искомых колиформных микроорганизмов и до начала основных исследований помещена в холодильник.

По результатам выполненных контрольных посевов рассчитывают необходимый объем природной воды. Объем инокулята природной воды должен содержать сотни - тысячи сапрофитных микроорганизмов. Использование обедненных по микробному составу природных вод в данных исследованиях нецелесообразно.

В установленный по содержанию сапрофитных микроорганизмов объем природной воды вносят расчетную посевную дозу тестового микроорганизма (E.coli).

Если природная вода содержит достаточное количество колиформных бактерий для посева требуемого количества на один фильтр, модельные микроорганизмы не используются. При необходимости природная вода может быть разведена в 10 и более раз.

Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Предварительно рассчитанную посевную дозу суспензии вносят в пробирки, содержащие не менее 10 мл разбавителя. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Количество пробирок, содержащих посевную дозу тестового микроорганизма, должно соответствовать количеству предполагаемых посевов методом мембранной фильтрации.

Фильтровальную установку готовят согласно общепринятым процедурам. Контроль стерильности фильтровальной установки проводят, как указано в п. 6.5. Стерильным пинцетом помещают мембранный фильтр на основание держателя фильтра и присоединяют фильтровальную воронку. При отключенном вакууме прибавляют 20 - 30 мл стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной воды. Содержимое пробирки с посевной дозой тщательно перемешивают и асептически переносят в воронку с разбавителем, включают вакуум и отфильтровывают.

Дважды, при включенном вакууме, ополаскивают воронку 20 - 30 мл стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной воды.

Вакуум отключают, снимают фильтровальную воронку и стерильным пинцетом переносят мембранный фильтр с основания на питательную среду. Между мембранным фильтром и поверхностью агара не должно быть пузырьков воздуха. Чашки с посевами переворачивают и инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

Посев инокулята природной воды осуществляется аналогично описанному выше с коррективами в отношении объема инокулята природной воды, который может быть 10 мл и более. В этом случае вносят соответствующее меньшее количество разбавителя или стерильной дистиллированной воды. Обязательно проводят двойное споласкивание воронки, как указано выше.

На первом этапе осуществляют отбор сред по параметрам, описанным в п. п. 11.1 - 11.3, 11.4.1 - 11.4.2.4.

На втором этапе отобранные среды оценивают по показателю "процент извлекаемости" с использованием двух способов посевов: прямого (по п. 11.4.2.5) и методом мембранных фильтров. Для каждой исследуемой среды и варианта посева должно быть выполнено не менее 5 повторов. Контролями служат прямой посев (контроль N 1) и посев мембранным методом (контроль N 2) на неселективную среду.

При необходимости могут быть проведены параллельные дополнительные исследования с инокулятом природной воды. Инокуляты природной воды с внесенными тестовыми микроорганизмами (или без них) засевают методом мембранных фильтров на исследуемые селективные среды.

Рассчитывается среднее количество колоний для каждой среды, способа посева и контрольных посевов. Общее количество колоний тестового микроорганизма на неселективной среде при посеве прямым методом должно быть не менее 200.

Согласно разделу 12 подтверждают качество используемых в эксперименте мембранных фильтров путем расчета "процента извлекаемости" для мембранных фильтров по средним результатам контрольных посевов (прямого N 1 и мембранного N 2) на неселективный агар.

Далее по п. 11.4.2.5 производят расчет процента извлекаемости и оценку достоверности различий для исследуемых сред. Контрольным результатом при этом служит среднее количество колоний, выросших при прямом посеве на неселективном агаре (контроль N 1).

При посевах природной воды с дополнительным внесением тестовых микроорганизмов в дальнейших расчетах учитывают полученные накануне результаты контрольного посева на наличие колиформ. Далее процент извлекаемости рассчитывается так же, как и в исследованиях с чистыми культурами: в сравнении с результатами прямого посева тестовых микроорганизмов на неселективный агар (контроль N 1).

В случае посевов природной воды без дополнительного внесения тестовых микроорганизмов оценивают достоверность различий результатов, полученных при посевах на исследуемые среды.

При получении недостоверных различий результатов исследований для выбора наиболее оптимальной среды необходимо проанализировать следующие характеристики:

- четкость проявления дифференцирующих признаков для тестового микроорганизма;

- подавление сопутствующей микрофлоры;

- выявление ингибирующего действия микробного населения природной воды на тестовую культуру Е.coli.