Законодательная база Российской Федерации

"ГОСУДАРСТВЕННЫЕ ИСПЫТАНИЯ И РЕГИСТРАЦИЯ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ. САНИТАРНЫЕ ПРАВИЛА. СП 3.3.2.561-96" (утв. Постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 31.10.96 N 33)

Приложение 1

1.1. Метод определения острой токсичности

Животные: мыши массой не более 20 г; крысы массой от 140 до 160 г; морские свинки массой от 250 до 350 г; кролики массой от 2,0 до 2,5 кг, животные других видов. Формирование групп животных, получающих разные дозы испытуемого препарата и препарата сравнения, проводят методом случайной выборки (единица выборки - животное).

При внутривенной инъекции объем вводимого препарата на 1 кг массы животного не должен превышать: для мышей - 25 мл, для крыс и морских свиней - 15 мл, для кроликов - 10 мл. Максимальные объемы должны вводиться мышам в течение 5 сек, крысам и морским свинкам - в течение 10 сек, кроликам - в течение 20 сек.

За животными наблюдают не менее 7 сут. после введения препарата.

Величину ЛД50 рассчитывают по результатам наблюдений через 30 мин, 24 ч и через 7 сут. и выражают в массовых, объемных или других единицах на 1 кг массы животного.

Материал для проведения гистологического исследования забирают от животных, которым испытуемый препарат был введен внутривенно, а также методом, предлагаемым для практики, в максимально переносимой дозе (МПД), не вызывающей гибели животных. Допускается проведение гистологического исследования органов одного вида животных, оказавшегося более чувствительным к токсическому воздействию препарата, и использование одной серии препарата, ЛД50 которой была наименьшей. Взятие материала осуществляют через 24 ч, 4 сут. и 7 сут. не менее чем от 5 животных на каждый срок, а также от всех животных, павших в течение наблюдения (см. п.5.2.4).

1.2. Метод определения хронической токсичности

Животные: см. "Определение острой токсичности".

Препарат вводят не менее, чем 20 животным один раз в сутки в оптимальной иммунизирующей (эффективной) дозе для данного вида животного или в дозе, эквивалентной предлагаемой для человека, при пересчете на 1 кг массы или площадь поверхности тела. Если препарат в течение 1 мес. предполагается применять человеку от 1 до 3-х раз, количество однократных ежедневных инъекций должно быть не менее 10, а более 3-х - не менее 20; перерыв в курсе введения не допускается.

Наблюдение за животными проводят в течение периода введения препарата и последующих 7 сут. При этом ежедневно регистрируют массу животных, а также возможные клинические симптомы интоксикации. Не менее 5 животных забивают на следующие сутки после последнего введения препарата и не менее 5 в день окончания наблюдения, и их органы подвергают гистологическому исследованию (см. п.2.4).

Гистологическому исследованию подвергают также органы всех животных, павших в течение периода наблюдения.

1.3. Метод определения влияния на детоксицирующую

функцию печени

Испытание проводят на беспородных белых мышах массой 18-20 г. Необходимо учитывать, что в условиях одного опыта колебания массы животных не должны превышать 1 г, в противном случае могут быть получены некорректные результаты.

Испытуемый препарат и препарат сравнения вводят внутрибрюшинно в дозе, которую предполагают использовать (используют) человеку; препараты, предназначенные для энтерального введения, вводят через рот.

Количество животных в каждой группе должно быть не менее 25. Раствор гексенала на дистиллированной воде вводят внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл из расчета 80-90 мг/кг массы животного (в зависимости от чувствительности животных, сезона и т.п.) через 48-72 ч после введения препарата.

Перед началом исследования рекомендуется оттитровать рабочую дозу гексенала, которая должна вызвать у интактных мышей наркоз продолжительностью от 30 до 40 мин. Необходимо учитывать, что животные должны находиться на полноценном пищевом режиме, т.к. голодание может увеличить продолжительность наркоза. Поскольку во время наркоза температура тела животных снижается, температура в помещении должна быть не менее 20°С.

Время введения гексенала каждому животному регистрируют с помощью секундомера. Для удобства работы можно вводить препарат небольшим группам (до 5) животных, фиксируя по секундомеру время введения препарата каждой группе. Заснувших мышей раскладывают на столе на боку.

Регистрируют время пробуждения каждого животного (проснувшимися считают мышей, вышедших из бокового положения) и определяют продолжительность наркоза. За продолжительность наркоза условно принимают время от момента введения гексенала до момента пробуждения.

Длительность гексеналового наркоза для группы животных (контрольной, получившей испытуемый препарат, препарат сравнения) рассчитывают с помощью средней арифметической или медианы. Расчет медианы имеет определенные преимущества, если в группах имеются длительно непросыпающиеся животные.

1.4. Метод определения токсичности препаратов бактериофага

Данные исследования проводят на белых мышах массой 18-20 г, в каждой группе - не менее 20. Необходимость проведения гистологических исследований зависит от биологических свойств бактерий, их способности к образованию эндотоксинов.

Определение острой токсичности предполагает однократное внутрибрюшинное введение фага в дозе, многократно превышающей максимальную разовую для человека в пересчете на единицу массы тела (100-200 раз). Животные не должны терять в весе, должны отсутствовать признаки заболевания и в месте введения препарата - инфильтраты. При исследовании периферической крови опытных животных после введения бактериофага не должны обнаруживаться значительные изменения в содержании лейкоцитов по сравнению с контрольной группой.

Определение хронической токсичности предполагает ежедневное внутрибрюшинное введение фага в течение 20 дней в дозе, эквивалентной максимально разовой дозе для человека в пересчете на единицу массы тела.

Наблюдения за животными проводят в течение всего периода введения и последующих 7 сут. с ежедневной регистрацией массы тела животных, а также возможных клинических проявлений интоксикации.

Определение местного действия бактериофага осуществляется в случае использования препаратов внутримышечно в дозе, предлагаемой для применения. Оценку проводят на основании данных осмотра на протяжении всего срока введения препарата и последующих 7 сут.

1.5. Метод определения токсичности аллергенов

Данное исследование осуществляется на двух видах животных: белых мышах - по 0,5 мл внутрибрюшинно, морских свинках - по 1 мл подкожно. В тех случаях, когда аллергены предназначаются для специфической иммунотерапии, что сопряжено с многократным их введением, оценку токсичности проводят с равным количеством подкожных инъекций морским свинкам (или кроликам) в дозах, рекомендуемых для практического применения.

При проведении настоящего испытания формируют две группы животных: получающих испытуемый препарат и соответствующий объем дистиллированной воды (контрольная группа).

Требования к дозе испытуемого препарата, пути его введения, экспериментальным животным и их количеству, методам статистической обработки те же, что и при постановке гексеналовой пробы.

Тиосемикарбазид (ТСК) или коразол вводят через 24-48 ч и 14 сут. после вакцинации. При постановке судорожных проб следует учитывать, что шум в помещении, резкие движения оператора и животных могут спровоцировать возникновение судорог. В связи с этим, после введения ТСК (коразола) животных следует содержать изолированно, помещая в прозрачные пластмассовые клетки, разделенные на мелкие отделения, или в стеклянные банки.

Введение коразола или ТСК интактным животным вызывает развитие судорог различного характера: клонические, тонические, клонико-тонические. Регистрируют время введения судорожного агента каждому животному, время развития каждого судорожного приступа, характер судорог, время гибели. Зная время введения вещества, вызывающего судороги, и наступления гибели мыши, определяют длительность жизни каждого животного.

2.1. Проба с ТСК

Раствор ТСК на дистиллированной воде вводят внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. Перед началом исследования определяют дозу препарата, которая должна вызвать у интактных мышей развитие судорожных приступов и последующую гибель почти всех животных (ЛД95). При этом первый судорожный приступ должен развиться через (40+5 мин), а гибель основного числа животных должна наступить через 70-90 мин. Как правило, эта доза находится в пределах от 18 до 25 мг/кг массы.

Регистрацию времени введения ТСК каждому животному, времени развития судорог и гибели осуществляют с помощью секундомера. За животным наблюдают в течение 3 ч.

Определяют среднюю длительность жизни мышей опытной и контрольной групп и достоверность различий между показателями.

2.2. Коразоловая проба

Раствор коразола на дистиллированной воде вводят подкожно в объеме 0,2 мл. Перед началом исследования определяют дозу препарата, которая должна вызывать у интактных мышей развитие судорог и последующую гибель почти всех животных. Как правило, эта доза находится в пределах от 90 до 100 мг/кг массы.

В отличие от пробы с ТСК при использовании коразола приступы судорог развиваются уже в первые минуты после введения препарата, а гибель основного числа животных наступает в течение 30 мин.

Регистрацию времени введения коразола, развития судорог и гибели животных проводят так же, как после введения ТСК. За животными наблюдают в течение 60 мин. Определяют среднюю длительность жизни мышей опытной и контрольной групп и достоверность различий между показателями.

3.1. Методика орального введения белым мышам, морским

свинкам, кроликам и обезьянам орального таблетированного МИБП

Принцип метода состоит в обеспечении контакта МИБП со слизистой ротовой полости в течение 2-3 мин.

Нарезают губку или другой пористый материал кусочками объемом: для белых мышей - 0,3-0,5 см3, морских свинок и кроликов - 0,5-1,0 см3, обезьян - 1-2 см3.

Таблетку измельчают и растворяют в таком количестве дистиллированной воды, чтобы 1 доза препарата для белой мыши или морской свинки содержалась в 0,5 мл, а для кролика - в 1 мл суспензии. Полученную суспензию сорбируют губкой, фиксированной в кровоостанавливающем зажиме. Мышей и морских свинок фиксируют в руке. Кроликов помещают в ящик для иммобилизации. Обезьян фиксируют за шею руками. Затем вводят губку в ротовую полость животного и удерживают ее в течение 2-3 мин. Все манипуляции выполняют осторожно, чтобы не повредить слизистую ротовой полости.

3.2. Методика энтерального введения кроликам и обезьянам

жидкой формы МИБП

Принцип метода состоит во введении жидкого препарата на неповрежденную слизистую с помощью трубки, проведенной через верхние отделы желудочно-кишечного тракта в двенадцатиперстную кишку.

У кроликов и обезьян натощак удаляют волосяной покров на участке, расположенном ниже мечевидного отростка по срединной линии живота, размером 5х15 см. У обезьян эту процедуру проводят после достижения полного наркоза.

Кроликов фиксируют на операционной доске животом вверх и наркотизируют до исчезновения болевой чувствительности. Обезьян фиксируют на операционной доске после проведения наркоза. Подготовленное операционное поле обрабатывают 3%-ным спиртовым раствором йода и ограничивают его стерильными салфетками с помощью корнцангов. После проведения верхнесрединной лапаротомии через разрез извлекают из брюшной полости желудок с прилежащим участком двенадцатиперстной кишки. Затем через рот, пищевод и желудок вводят в двенадцатиперстную кишку на глубину 2-4 см газоотводную трубку, которую фиксируют пальцами в области перехода из желудка в кишечник. Все манипуляции выполняют через стенку желудка. После этого другой лаборант через губку при помощи шприца вводит 1-2 мл жидкой вакцины с последующим промыванием трубки физиологическим раствором объемом 20-30 мл. Желудок и кишечник помещают в брюшную полость и вводят в нее 2 мл раствора антибиотиков (100-200 тыс.ед/мл). Операционную рану послойно зашивают. Все манипуляции выполняют с помощью стерильных инструментов и материалов с соблюдением правил асептики и антисептики.

Первое кормление животных допускается на следующий день после операции. Продолжительность наблюдения за животными - до 30 сут (в зависимости от цели исследования). Отход животных во время операции и в период наблюдения составляет не более 5% и обусловлен оперативным вмешательством.

3.3. Методика энтерального введения кроликам и обезьянам

Животных усыпляют эфирным наркозом. При вскрытии и осмотре внутренних органов отмечают состояние серозных покровов и содержимое полостей. Определяют, сравнивая с контрольной группой животных, массу, цвет, степень кровонаполнения органов, наличие гемодинамических нарушений. Вырезают кусочки из внутренних органов подопытных и контрольных животных (головного и спинного мозга, легких, печени, почек, надпочечников, желудка, тонкого и толстого кишечника, поджелудочной железы, тимуса, зпифиза, щитовидной железы, селезенки, лимфатических узлов разной локализации). Спинной мозг извлекают из позвоночника после фиксации.

Фиксацию материала проводят в 10-12%-ном растворе формалина с последующей промывкой, проводкой через спирты и заливкой в парафин. При резке на каждое стекло помещают не менее 2-х срезов, которые окрашивают гематоксилинэозином. Для уточнения характера выявленных изменений могут быть использованы гистохимические и другие морфологические методы исследования (окраска на фибрин, липиды, мукополисахариды и т.д.).

При изучении препаратов обращают внимание на наличие изменений в системе микроциркуляции: признаки перераспределения крови с депонированием ее в паренхиматозных органах; явления стаза и плазмостаза; агрегацию эритроцитов в капиллярах и тромбообразование; повышение проницаемости стенок сосудов с развитием геморрагий, плазморрагии, мукоидной, фибриноидной дезорганизации, фибриноидного некроза.

Кроме микроциркуляторных нарушений выявляют также наличие дистрофических и воспалительных изменений во внутренних органах.

При изучении легких отмечают состояние бронхиальной системы (бронхоспазм, отек стенок, десквамация слизистой оболочки, наличие кровоизлияний и воспалительной реакции), обращают внимание на признаки эмфиземы, циркуляторных и воспалительных изменений. В сердце изучают межуточную ткань миокарда (стек стромы, мукоидное набухание, воспалительная инфильтрация, продуктивная реакция), саркоплазму (дискоидный распад миофибрилл, миоцитолиз), эндокард, перикард (отек, клеточная реакция). В печени и почках определяют вид и выраженность дистрофических и воспалительных изменений. Описывают характер изменений в тимусе, селезенке, лимфатических узлах разной локализации, костном мозге. В ЦНС исследуют состояние микроциркуляторного русла, а также нейронов в коре, подкорковых образованиях, гипоталамусе, стволе и спинном мозге.

Приложение 2

Индивидуальная карта привитого

Приложение 3

Оформляется в соответствии с п.6.1.1, за исключением ее наименования, например:

"Программа Государственных испытаний вакцины бруцеллезной химической сухой".

Должна содержать следующие разделы:

- введение;

- цель и задачи;

- характеристика испытуемого препарата и препарата сравнения;

- характеристика контингентов;

- методические принципы проведения строго контролируемых испытаний;

- изучение реактогенности и безопасности препарата;

- изучение иммунологической эффективности;

- изучение профилактической эффективности;

- учреждения, ответственные за выполнение отдельных фрагментов испытания;

- приложение.

3.1. Во введении излагаются проблемы, связанные с эпидемиологией и профилактикой инфекции, применительно к которой изучается препарат. Обосновывается актуальность изучения вновь разработанного препарата и потенциальная возможность его использования в практике здравоохранения. Состояние по разработке и применению аналогичных препаратов за рубежом.

Необходима ссылка на решение Комитета по МИБП о разрешении проведения Государственных испытаний, излагаются результаты ограниченных клинических испытаний препарата.

3.2. Характеристика испытуемого препарата и препарата сравнения.

В этом разделе программы дается краткое описание препарата, его основное назначение, возрастные дозировки и схемы их введения. Необходимо изложить данные о фасовке препарата, сроках и условиях его хранения, сроки годности. Аналогичная информация должна быть представлена по препарату сравнения или плацебо. Серии испытуемого препарата, препарата сравнения и плацебо должны быть отконтролированы в ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

3.3. Учреждения, ответственные за выполнение отдельных фрагментов полевых испытаний.

Этот раздел программы составляется в соответствии с п.6.1.7 настоящего документа.

Результаты полевых испытаний оформляются в виде отчета, который рассматривается Комитетом МИБП и представляется на утверждение председателя Комитета МИБП.

Отчет должен содержать следующие разделы:

- введение;

- материалы и методы;

- оценка реактогенности и безопасности;

- оценка иммунологической эффективности;

- оценка профилактической эффективности;

- заключение по результатам испытания.

В разделе "Заключение по результатам испытания" необходимо указать целесообразность (или нецелесообразность) внедрения препарата (регистрации) в практику здравоохранения РФ, а также указать данные или материалы, которые необходимо внести в "Инструкцию по применению препарата".

Приложение 4

1.1. Методики изучения сенсибилизирующих свойств

Определение немедленной аллергии связано с использованием методов, выявляющих реагиноподобные антитела. Информация может быть получена путем воспроизведения одной из общепринятых схем анафилаксии у морских свинок. Для сенсибилизации используют модели с учетом путей и схем введения аллергенов в организм больного. Поскольку аллергены, предназначенные для специфической иммунотерапии, вводят многократно, для сенсибилизации можно рекомендовать следующую схему: препарат вводят трехкратно с интервалом в 1 сут. подкожно. Разрешающую инъекцию проводят внутривенно или внутрисердечно спустя 2-3 нед. после последней инъекции.

Для регистрации гиперчувствительности замедленного типа используют феномен изменения массы конечностей белых мышей. Животных сенсибилизируют путем трехкратного с интервалом в 3 сут. внутрибрюшинного введения аллергена в дозах, рекомендуемых для применения в практике (но не более 0,5 мл) или путем однократного введения в подушечки лап концентрированной формы аллергена. Спустя 7 сут. после заключительной инъекции делают разрешающее введение аллергена в объеме 0,05 мл в подушечку одной из задних лап, а во вторую - 0,05 мл разводящей жидкости для аллергенов. Уровень специфической воспалительной реакции оценивают по разнице в массе конечностей.

1.2. Оценка специфической активности

Для сенсибилизации морских свинок можно использовать одну из общепринятых схем: однократное введение в подушечки лап концентрированной формы аллергена, содержание белка в которой многократно превышает таковое в препаратах, рекомендуемых для практического применения, в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Постановку кожных проб осуществляют спустя 14-21 сут. после сенсибилизирующей инъекции.

Метод активной анафилаксии с последующей десенсибилизацией: морских свинок сенсибилизируют по описанной выше схеме для диагностических аллергенов. Спустя 14-21 сут. проводят десенсибилизацию путем повторных подкожных введений возрастающих доз одноименного аллергена (25-100 % к сенсибилизирующей дозе). Кратность и интервалы введения определяют экспериментальным путем. Для разрешающей инъекции используют внутривенное введение аллергена в дозе, равной последней десенсибилизирующей дозе. Десенсибилизированные животные слабо реагируют на разрешающее введение аллергена. Сенсибилизированные морские свинки, не подвергшиеся десенсибилизации (контроль), реагируют на разрешающее введение аллергена развитием анафилактического шока.

2.1. Определение терапевтической эффективности бактериофага
при лечении экспериментальной бактериальной инфекции

Группу животных (мышей массой 18-20 г) заражают внутрибрюшинно соответствующими бактериями от 3-100 ЛД50. Фаготерапию проводят ежедневно внутрибрюшинно с указанием содержания фаговых частиц в вводимой дозе. В качестве препарата сравнения следует использовать питательную среду, на которой готовился изучаемый препарат бактериофага. Наблюдение в течение 30 дней с регистрацией живых и павших животных в опыте и контроле. Критериями оценки эффективности фаготерапии экспериментальной бактериальной инфекции является:

- выживаемость зараженных животных;

- обсемененность внутренних органов зараженных животных, определяемых методом отпечатков.

Приложение 5

Наименование и адрес учреждения, где
проводятся испытания

Врач-аллерголог (подпись)

М.п.

Заверяю

Приложение 6

Ф.И.О. больного

Пол.

Возраст

Диагноз

Наименование аллергена (серия N, к N ОБТК)

Дата начала лечения.

Способ введения аллергена

Подпись врача-аллерголога

Приложение 7

\r\n \r\nСерия N _______, к N ОБТК _________\r\nСрок годности _______________________\r\nИспытания аллергена ________________\r\nбыли проведены на базе _______________________________\r\nв период с ____________________ по ___________________\r\nОбследованы больные со следующими формами заболеваний\r\nВ том числе:\r\nа) Контрольная группа _____ человек в возрасте от _____ до\r\n_______;\r\nб) Группа больных ____ человек в возрасте от_____ до ____\r\nАллерген использовали методом _____________ (прик,\r\nскарификационный, внутрикожный, ингаляционный, интраназальный,\r\nконъюнктивальный)\r\nДиагностическая доза для каждого из тестов ( /мо; объем) (для\r\nдетей указать дозы отдельно по возрастам)\r\nСроки учета реакций __ (немедленные, отсроченные, замедленные)\r\nЧисло положительных реакций в контрольной группе _____ (%), в\r\nтом числе гиперергических реакций _____ (%)\r\nЧисло положительных реакций в группе больных ____ (%), в том\r\nчисле гиперергических _______\r\nНаличие, характер, выраженность общих реакций:\r\n а) в контрольной группе ______;\r\nб) в группе больных _______ Замечания об особенностях реакций\r\nна аллерген (не перечисленных выше)\r\n___________________________________\r\nГиперергическими следует считать кожные реакции, размеры\r\nкоторых больше максимальных, предусмотренных наставлением по\r\nприменению.\r\n \r\n Схема предложения\r\nАллерген __________________ апробированный на больных\r\n___________________ (с учетом результатов обследования контрольной\r\nгруппы) оказался пригодным для целей диагностики. Испытание\r\nаллергена проводилось в соответствии с НТД.\r\nВ случае негативных результатов испытаний дается\r\nмотивированный отзыв.\r\nОтзыв подписывается руководителем учреждения, на базе которого\r\nпроводилось испытание препарата. Подпись заверяется в\r\nустановленном порядке, скрепляется печатью.\r\nОтзыв представляется в Комитет МИБП в двух экземплярах,\r\n \r\n \r\n

Приложение 8

\r\nСерия N ______ к N ОБТК_____\r\nСрок годности __________________\r\nИспытание аллергена проводилось на базе ________________\r\nв период с ___________ до _____________\r\nКурс специфической иммунотерапии проведен у ______ больных со\r\nследующими нозологическими формами заболевания\r\n___________________________\r\nПродолжительность курса лечения составила:\r\nДо 1 месяца ___ больных.\r\nОт 1 до 2-х месяцев ___ больных. От 2-х до 4 месяцев _______\r\nбольных. Более 5 месяцев _______ больных.\r\nЗарегистрированные побочные реакции, связанные с проведением\r\nспецифической иммунотерапии:\r\n- местные ___________ больных (%)\r\n- органные и общие (нарушения гемодинамики, температурная\r\nреакция и др.) _______________ больных (%)\r\nОтклонения от нормы по данным лабораторных исследований\r\n(биохимических, иммунологических, клинический и др.)\r\n______________ больных (%).\r\nЭффективность курса специфической иммунотерапии установлена по\r\nистечении _________________ (срок).\r\nКритерии оценки по клиническим показателям результатов\r\nиммунотерапии: "Отличный" (4 балла) - после лечения исчезли все\r\nпроявления заболевания __________ больных (%).\r\n"Хороший" (3 балла) - проявления болезни стали очень редкими и\r\nлегкими, выраженных приступов нет ___ больных (%).\r\n"Удовлетворительный" (2 балла) - симптомы заболевания\r\nостались, но стали легче и реже __________ больных (%).\r\n"Без эффекта" (1 балл) - улучшения не наступило ________\r\nбольных (%),\r\nПроведение специфической иммунотерапии аллергенов ___ у\r\nбольных (нозологические формы заболеваний) показало, что\r\nиспытуемый препарат не вызывает побочных реакций и обусловил\r\nтерапевтический эффект у __________ больных (%).\r\nВ случае негативных результатов испытаний дается\r\nмотивированный отзыв.\r\nОтзыв подписывается руководителем учреждения, проводившего\r\nиспытание. Подпись заверяется в установленном порядке, скрепляется\r\nпечатью. Отзыв представляется в Комитет МИБП в двух экземплярах.

Приложение 9

Развитие специфического иммунного ответа при вакцинации сопровождается неспецифическими изменениями иммунной системы, которые могут привести к ослаблению устойчивости организма к другим инфекционным агентам, иммунодефицитным состояниям и аллергии. В связи с этим общая схема испытания новых вакцин предусматривает изучение иммунологической безопасности этих препаратов. Изучение проводится на доклиническом и клиническом уровнях.

Лабораторно-экспериментальное (доклиническое) изучение включает оценку состояния иммунной системы экспериментальных животных после введения им испытуемой вакцины (исследование селезенки, численности и функции иммунокомпетентных клеток); исследование резистентности к возбудителям других инфекций; изучение аллергизирующего действия вакцины и аутоиммунных реакций на вакцинацию.

Клиническое изучение иммунологической безопасности осуществляется в два этапа. В рамках первого этапа на ограниченной группе людей проводятся клинико-лабораторные исследования, которые включают: оценку иммунного статуса, выявление изменений иммунологической реактивности на неродственные инфекционные агенты, определение аллергических и аутоиммунных реакций. На втором этапе клинических испытаний в контролируемых полевых условиях у вакцинированных выявляются иммунозависимые заболевания, развившиеся в результате неспецифических изменений иммунной системы после вакцинации.

1.1. Определение фагоцитарной активности макрофагов.

Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) выделяют асептически от 3-5 мышей опытной и контрольной групп и помещают в среду 199, содержащую 5 ME гепарина в 1 мл, в пробирки, стоящие на льду. Не используют экссудаты, содержащие эритроциты. После осаждения (150 g, 10 мин) клетки ресуспендируют в среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота с антибиотиками (100 ед/мл). Концентрацию клеток доводят до 1,0-2,0х106 кл/мл и суспензию разливают по 2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в термостат при температуре (37+-2)°С с содержанием 5% СО2. Через 60 мин смывают неприлипшие клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей среды и оставляют на 18-24 ч в термостате с 5-7% СО2 при температуре (37+-2)°С.

Клетки для исследования фагоцитоза можно получать также на половинках покровных стекол, помещенных в пробирки с 1,5+-2 мл КПЭ.

Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана, дрожжеподобные грибы Candida albicans или лабораторный штамм Staphylococeus (N 9198) или любые другие микробные клетки.

Эритроциты барана (ЭБ) *(1) трижды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия, осаждая на центрифуге при 800 g в течение 5 мин. Готовят 0,5%-ную взвесь ЭБ на среде 199.

Суточные культуры живых или убитых прогреванием при температуре (90+2) градусов С в течение 45-60 мин микроорганизмов отмывают путем центрифугирования не менее 3-х раз 0,9%-ным раствором хлорида натрия, ресуспендируют в нем и определяют концентрацию суспензии по стандарту оптической мутности. Взвесь разводят средой 199 до концентрации, соответствующей предварительно установленному соотношению (1,0-2,0(9) кл/мл).

В чашки Петри, содержащие КПЗ, наливают 1 мл свежей среды и вносят по 1 мл взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов. Через 30-60 мин чашки ополаскивают холодным раствором Хенкса, подсушивают и фиксируют 10 мин метанолом. Окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимзе.

Учет результатов. Просматривают не менее 200 клеток, подсчитывая фагоцитирующие клетки и количество содержащихся в них ЭБ или микробов.

Результаты выражают процентом фагоцитирующих клеток (ПФ) и фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется количеством частиц на один фагоцит.

1.2. Исследование селезенки.

После забоя животных во время вскрытия проводят макроскопическое и микроскопическое изучение селезенки, оценивают степень ее кровенаполнения и отека, измеряют величину и массу органа.

1.3. Исследование клеточного состава и пролиферативной
активности клеток селезенки.

Из селезенки готовят взвесь клеток, 0,2 мл такой взвеси подвергают центрифугированию, осадок разводят в 0,2 мл цельной декомплементированной сыворотки крови, ресуспендируют, подвергают повторному центрифугированию и из осадков готовят мазок на предметном стекле, аналогично мазку крови. Далее мазок высушивают, фиксируют 10-15 мин в метаноле и окрашивают по методу Романовского-Гимза.

Морфологическое исследование проводят при увеличении 100х10 (масляная иммерсия), подсчитывая в 2000 клеток % клеток разных рядов кроветворения и среди них % делящихся клеток (митозов).

Кроме того, в селезенке оценивают состояние белой и красной пульпы: выраженность лимфоидных фолликулов, их величину, активность реактивных центров, а также Т- и В-зависимых зон, развитие гиперплазии последней, степень миэлоза пульпы селезенки, определяют характер восстановительных процессов.

1.4. Получение взвеси клеток селезенки.

Мышей забивают с помощью хлороформа. Извлекают селезенку, взвешивают ее на торсионных весах, осторожным раздавливанием в стеклянном гомогенизаторе готовят взвесь клеток из расчета 1 мл среды 199 на 50 мг ткани селезенки. Полученную суспензию фильтруют через 2 слоя капроновой сетки.

0,5 мл взвеси спленоцитов отмывают 5 мл среды 199 путем центрифугирования в течение 10 мин при 150 g, надосадок удаляют, а осадок разводят средой 199 с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед/мл) до исходной концентрации. Необходимо подчеркнуть, что клетки селезенки каждой мыши следует использовать индивидуально, не создавая клеточных цулов. Для сравнения результатов следует использовать среднегрупповые величины.

Примечание. Для пересчета G на число оборотов, соответствующее данной центробежной силе, следует пользоваться формулой:

где:

N - число оборотов в мин;

R - радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл-верографина с клетками, см;

G - центробежная сила.

1.5. Определение количества Т-клеток (цитотоксический тест).

Принцип метода заключается в том, что антитела, направленные против различных лимфоцитарных антигенов, фиксируются специфически на клетках, содержащих эти антигены, и в присутствии комплемента нарушают целость клеточной мембраны. Образовавшиеся отверстия в мембране лимфоцитов позволяют прибавленному к взвеси красителю (трипановый синий) проникнуть внутрь клетки и окрашивать ее. Жизнеспособные с интактной мембраной клетки этим красителем не окрашиваются.

Коммерческую поликлональную сыворотку против Т-лимфоцитов мыши разводят средой 199 до рабочей концентрации, указанной на этикетке. В центрифужной пробирке или в лунке панели смешивают 60 мкл сыворотки, 20 мкл исследуемой взвеси лимфоцитов (концентрация 10(7) кл/мл) и 20 мкл комплемента кролика в разведении 1:3. В контрольные пробирки или лунки вносят 20 мкл взвеси лимфоцитов (концентрация 10(7) кл/мл), 20 мкл комплемента и 60 мкл среды 199. Смеси перемешивают и инкубируют в термостате при температуре (37+-2)°С 25-30 мин. В каждую пробирку или лунку добавляют по 100 мкл раствора трипанового синего*(2). Через 30-60 сек помещают взвесь из лунки в счетную камеру.

Учет результатов. Определяют число погибших клеток, вычисляют их процент от общего количества клеток в препарате, подсчитывают цитотоксический индекс (ЦТИ) по формуле:

Оценка результатов. ЦТИ Указывает, какой процент клеток среди исследуемой взвеси несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит к данной популяции. Так, например, если при исследовании клеток селезенки ЦТИ составил 32%, можно заключить, что 32 % этих клеток составляют Т-лимфоциты.

1.6. Определение количества В-лимфоцитов (цитотоксический тест).

Общее количество всех В-клеток определяется в цитотоксическом тесте с коммерческой поликлональной специфической сывороткой против В-лимфоцитов мыши. Постановка теста аналогична постановке цитотоксического теста с анти-Т-сывороткой.

1.7. Определение гиперчувствительности немедленного типа: феномен Овери у морских свинок.

Феномен Овери - кожная анафилаксия, при которой происходит быстрое повышение проницаемости капилляров кожи под влиянием реакции антиген-антитело.

Опыты проводят на белобоких морских свинках массой 200-300 г.

Исследуемую вакцину вводят по следующей схеме. Сенсибилизирующие инъекции вакцины: первая подкожно, две последующие с интервалом в 1 сут. - внутримышечно в область бедра. Доза препарата, вводимого на одну инъекцию, равна дозе, предлагаемой для введения человеку. Разрешающую инъекцию проводят внутрикожно на 18-25 день после первой сенсибилизирующей инъекции. Для разрешающей инъекции вводят препарат в дозе, равной или превышающей в 5-10 раз однократную сенсибилизирующую дозу.

Контролем служат несенсибилизированные животные, получившие только разрешающую инъекцию вакцины.

Через 5-7 мин опытной и контрольной группе внутрисердечно или внутривенно вводят 0,5-1,0 мл 1%-ного водного раствора голубого Эванса.

Учет результатов. Через 20 мин в опытной группе, в случае развития анафилаксии от препарата, на месте введения разрешающей его дозы появляется синее пятно. У животных контрольной группы пятно не должно появляться.

2.1. Методы получения материалов для исследования иммунного статуса.

2.1.1. Взятие крови.

Кровь у обследуемого берут в асептических условиях иглой из локтевой вены в две стерильные бактериологические пробирки:

10,0 мл крови - в пробирку с гепарином *(3) (25 ед/мл крови) и 5,0 мл крови - в сухую пробирку для получения сыворотки. Кровь с гепарином хранят при 6-8 градусов С не более 4 ч, длительность хранения должна быть стандартной для всего цикла исследований.

2.1.2. Выделение фракции лимфоцитов для изучения их популяционного состава.

В бактериологические пробирки разливают забуференный 0,9%-ный раствор хлорида натрия рН 7,2-7,3 *(4) (или раствор Хенкса, или среду 199) по 2,0 мл, добавляют равный объем гепаринизированной крови. Разведенную таким образом вдвое кровь отбирают пастеровской пипеткой и наслаивают на смесь фиколл-верографина *(5) (1,5 мл). Соотношение объема смеси к объему разведенной крови может составлять 1:2-1:5. Между кровью и фиколл-верографином определяется четкая граница, одного, уже в первые минуты после наслаивания, эритроциты крупными хлопьями начинают опускаться на дно емкости.

Пробирки с кровью и градиентом плотности центрифугируют при 400 g 30-40 мин.

В результате центрифугирования образуются фракции: 1-я сверху - слегка опалесцирующая - плазма крови и буферный раствор; 2-я - белый диск, содержащий мононуклеарные клетки крови; 3-я - прозрачная - градиент фиколл-верографина; 4-я - осадок эритроцитов и гранулоцитов.

Слой мононуклеаров пастеровской пипеткой отбирают в центрифужную пробирку. Мононуклеарные клетки три раза отмывают тем же буферным раствором путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок отмытых лимфоцитов суспендируют в 0,5 мл буферного раствора. Жизнеспособность клеток определяют окрашиванием трипановым синим (см.п.1.5). Взвесь лимфоцитов готовят на среде 199, концентрация клеток 2х10(6) кл/мл. Выход лимфоцитов из 1,0 мл цельной крови составляет 1-1,5х10(6) клеток. Исследования проводят в тот же день.

2.1.3. Получение сыворотки крови.

Кровь, помещенную в пробирки (п.2.1.1), инкубируют в термостате при (37+-2)°С 1 ч. После обведения сгустка пастеровской пипеткой пробирки помещают в холодильник (6-8°С) на 18 ч. Затем образовавшуюся сыворотку переносят в стерильные пробирки и хранят до исследования в холодильнике при температуре минус (20+-2)24°С.

2.2. Методы выявления аллергизирующего действия вакцин, развития аутоиммунных реакций.

2.2.1. Определение общего иммуноглобулина Е человека (Ig-E) в сыворотке крови (ИФА).

Используют иммуноферментные Ig-Е-тест-системы. Постановку реакции осуществляют согласно инструкции к набору, в которой указаны методы приготовления всех необходимых растворов. Оценку результатов проводят на спектрофотометре типа Multiscan при соответствующей длине волны.

У взрослых нормальное содержание Ig-E в пределах 100- 130 кЕ/л *(6). Содержание Ig-E у вакцинированных выше 150 кЕ/л может свидетельствовать об аллергизирующем действии вакцины.

Определение аутоантител на тканевые аутоантигены (ИФА).

Для определения в сыворотках крови привитых аутоантител к нативной и денатурированной ДНК используют коммерческие тест-системы. Постановку реакции осуществляют согласно инструкции к набору. При работе используют спектрофотометр типа Multiscan.

Учет результатов. Вычисляют индекс (И) иммуноферментной реакции. Он равен частному от деления оптической плотности (ОП) положительной сыворотки на ОП отрицательной сыворотки и частному от деления ОП анализируемой сыворотки на ОП отрицательной сыворотки.

Оценка результатов. Если частное от деления ОП анализируемой сыворотки на ОП отрицательной сыворотки >1,1 (при анализе антител к нативной ДНК) и >1,3 (при анализе антител к денатурированной ДНК), то иммуноферментную реакцию считают положительной. При наличии И >=2 анализ свидетельствует о появлении риска развития аутоиммунных реакций.

2.3. Изучение иммунного статуса.

2.3.1. Определение количества лейкоцитов в крови.

Для определения количества лейкоцитов 0,1 мл крови вносят в пробирку с 1,9 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты. Затем каплю содержимого пробирки помещают в камеру Горяева. Под световым микроскопом подсчитывают количество ядросодержащих клеток в 100 квадратах (или 25 "окнах"). Исходя из полученного числа клеток, вычисляют количество лейкоцитов в 1 мл крови.

2.3.2. Определение лейкоцитарной формулы.

Готовят мазок крови на предметном стекле, высушивают его на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в этиловом (10 мин) или метиловом (4 мин) спирте. Фиксированный мазок красят азур-эозином по Романовскому-Гимзе. Мазки просматривают в световом микроскопе под иммерсией. На каждом стекле просчитывают не менее 200 клеток. Исходя из полученных результатов вычисляют процентное содержание нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и других клеток белой крови. Затем подсчитывают их абсолютное количество в 1 л крови.

2.3.3. Определение фагоцитарной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов.

В силиконированной *(7) стерильной пробирке смешивают 0,2 мл гепаринизированной крови (25 ед/мл крови) и 0,1 мл взвеси культуры микроорганизма в концентрации 1-2х10(9) кл/мл. Смесь клеток инкубируют в течение 1 ч при температуре (37+-2)°С и затем готовят мазки на предметном стекле. Приготовленные таким образом препараты высушивают на воздухе при температуре 18-20°С, фиксируют этиловым спиртом или метанолом в течение (10+-1) мин и окрашивают 0,5%-ным раствором метиленового синего или раствором метилового зеленого пиронина *(8) - в течение 60 мин. После окрашивания мазки ополаскивают водой, промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе при температуре (18-20)°С. Работу по окрашиванию препарата проводят в лабораторном химическом шкафу с вытяжкой.

Учет результатов. В мазке под микроскопом с масляной иммерсией сосчитывают число клеток с фагоцитированным материалом на 200-300 полиморфноядерных лейкоцитов и количество поглощенных клеток в каждом лейкоците. Оценку фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови проводят по следующим показателям процент фагоцитоза (ПФ) - относительное количество лейкоцитов крови, обладающих фагоцитарной активностью, выраженной в процентах; фагоцитарное число (ФЧ) - количество поглощенных клеток из расчета на один лейкоцит; абсолютный фагоцитарный показатель (АФП) - суммарный показатель активности полиморфноядерных лейкоцитов крови, рассчитывают по формуле:

АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл х ФЧ

Подсчитывают количество полиморфноядерных лейкоцитов в 1 мкл крови, затем определяют количество фагоцитирующих лейкоцитов в 1 мкл крови.

Пример: общее количество лейкоцитов 1 мкл крови - 5000 с содержанием полиморфноядерных лейкоцитов - 60%

ПФ - 80%

ФЧ - 5

а) общее число лейкоцитов 5000 - 100%

полиморфноядерных лейкоцитов Х - 60 %

полиморфноядерных лейкоцитов = 3000

б) полиморфноядерных лейкоцитов 3000 - 100%

фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов Х - 80%

фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов = 2400

в) АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл крови х ФЧ

АФП=2400х5=1200

Приготовление реактивов (см. сноски *(7) и *(8) на предыдущей странице).

2.3.4. Определение численности Т-клеток, зрелых Т-клеток, Т-супрессоров, Т-хелперов, В-клеток, киллеров методом непрямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами.

Для определения субнопуляций Т-клеток у человека можно использовать метод розеткообразования и метод иммунофлюоресценции с моноклональными антителами. Последний является более точным.

Принцип метода основан на том, что антилимфоцитарпые мышиные моноклональные антитела присоединяются к соответствующим антигенным маркерам поверхности лимфоцита, а участки их фиксации выявляются при помощи антител к lg мыши, меченых ФИТЦ. Количество клеток, на поверхности которых обнаруживается свечение, характеризует численность субпопуляций, против маркеров которой были получены соответствующие моноклональные антитела (МкА). Постановку реакции осуществляют согласно инструкции к набору моноклональных антител.

На стадиях доклинических и клинических испытаний кроме описанных выше методов рекомендуется проводить дополнительные исследования состояния иммунной системы, которые не являются обязательными и выполняются в зависимости от результатов иммунологических исследований первого уровня. Дополнительные исследования включают: реакцию спонтанной бластгрансформации лимфоцитов, реакцию бласттрансформации лимфоцитов под влиянием Ти В-митогенов (ФГА, Кон А, ЛПС), определение функциональной активности регуляторных Т-лимфоцитов (Т-хелперов, Т-супрессоров), реакцию торможения миграции макрофагов и лейкоцитов, пассивную кожную анафилаксию в опытах на морских свинках и мышах, индукцию замедленной гиперчувствительности и экспериментального аллергического энцефаломиелита на животных, определение уровня различных цитокинов, оценку клеточного иммунитета у людей по кожным реакциям замедленной гиперчувствительности на РРД, кандидин, трихофитин и пр. Для проведения дополнительных исследований можно пользоваться методиками, описанными в различных методических руководствах по иммунологии.

*(1) Кровь барана, взятую в консервант крови, можно хранить до 10 сут. при 6-8°С.

*(2) Приготовление раствора трипанового синего. Для приготовления 0,5%-ного раствора 500 мг красителя растворяют в 100 мл горячего (80-90°С) 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Раствор перемешивают 10 мин на магнитной мешалке и фильтруют через фильтровальную бумагу. Готовый раствор хранят в плотно закрытом сосуде при температуре 10-20°С. Непосредственно перед употреблением раствор красителя фильтруют через тонкий слой ваты, чтобы избавиться от осадка.

*(3) Приготовление гепарина. Сухой гепарин растворяют в дистиллированной воде в объеме, указанном на этикетке, раствор стерилизуют фильтрованием через фильтры Миллипор и хранят при 6-8 градусов С в течение одного цикла исследований. Из основного раствора гепарина готовят его рабочий раствор на среде 199 с таким расчетом, чтобы в 0,5 мл содержалось 250 ед. активности.

*(4) Приготовление 0,9%-ного раствора хлорида натрия буферного (рН 7,2). К 7,0 хлорида натрия добавляют 2,0 г двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,3 г однозамещенного фосфорнокислого калия, доводят до 1000 мл ТДВ, рН 7,2.

*(5) Приготовление смеси фиколл-верографина (плотность 1,077). Смесь готовят на тридистиллированной автоклавированной воде (ТДВ): а) Из 76%-ного раствора верографина готовят 33,9%-ный раствор (плотность 1,200); к 33,9 мл 76%-ного верографина добавляют 42,1 мл ТДВ; б) 9%-ный раствор фиколла (плотность 1,025): к 10,8 г фиколла добавляют 109,2 мл ТДВ (подогретой до 30-40 грудусов С); в) соединяют 7 частей раствора верографина и 16 частей раствора фиколла: к 52,5 мл верографина добавляют 120 мл фиколла. Плотность смеси измеряют ареометром, плотность смеси должна быть 1,077. Смесь хранят в темном флаконе в холодильнике при 6-8°С две недели.

*(6) кЕ/л (система СИ) = Е/мл

*(7) Силиконирование посуды. Чистые пробирки ополаскивают силиконом, помещают в фильтровальную бумагу вверх дном для того, чтобы стекли остатки силикона из пробирок, выдерживают в таких условиях в течение 1 ч, затем помещают их в сушильный шкаф на 1,5 ч при температуре 120-140°С, затем промывают пробирки дистиллированной водой и вновь выдерживают в сушильном шкафу в указанном режиме. Работу по силиконированию посуды проводят в лабораторном химическом шкафу с вытяжкой.

*(8) Приготовление краски метиловый-зеленый пиронин. Предварительно готовят растворы "а" и "б", перед использованием смешивают указанные растворы в соотношении 1:1. Раствор "а" состоит из смеси следующего состава: 17,5 мл 5%-ного водного раствора пиронина, 10 мл 2%-ного раствора метилового зеленого (метиловый зеленый должен быть предварительно промыт хлороформом и высушен на воздухе), 250 мл дистиллированной воды. Раствор "б" - ацетатный буферный раствор в концентрации 0,2 моль/м, рН 4,8.

Приготовление ацетатного буферного раствора 0,2 М рН 4,8. К 120 мл раствора ацетата натрия в концентрации 0,1 моль/м3 (16,3 г ацетата натрия на 1 л дистиллированной воды) доливают около 80 мл раствора уксусной кислоты той же концентрации (4,61 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л дистиллированной воды), доводят рН раствора до 4,8.

Приложение 10

Временная фармакопейная статья

Издание официальное Перепечатка воспрещена

Приложение 11

Фармакопейная статья

Издание официальное Перепечатка воспрещена

Приложение 12

Оформление последнего листа ФС
(пример)

 \r\nТекст последних разделов фармстатьи\r\n \r\nДиректор Пермского НИИВС ___________ Фамилия, инициалы\r\n                                      _______________ 19___ г.\r\nОсновные исполнители:\r\nЗав. лабораторией ________________ Ф.,И.,О.\r\n(наименование лаборатории)            _______________ 19___ г.\r\n \r\nСт.научный сотрудник ________________ Ф.,И.,О.\r\n(наименование лаборатории)            _______________ 19___ г.\r\n \r\nДиректор НИИЭМ ________________ Ф.,И.,О.\r\n   им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ              _______________ 19___ г.\r\n \r\nОсновные исполнители:\r\n \r\nЗав. лабораторией ________________ Ф.,И.,О.\r\n(наименование лаборатории)            _______________ 19___ г.\r\n \r\nСт.научный сотрудник ________________ Ф.,И.,О.\r\n(наименование лаборатории)            _______________ 19___ г.\r\n \r\nДиректор предприятия,\r\nпредставляющего образцы\r\nсерий для контроля ________________ Ф.,И.,О.\r\n                                      _______________ 19___ г.\r\nГлавный технолог ________________ Ф.,И.,О.\r\n                                      _______________ 19___ г.\r\nНачальник цеха ________________ Ф.,И.,О.\r\n                                      _______________ 19___ г.\r\nЗаведующий ОБТК ________________ Ф.,И.,О.\r\n                                      _______________ 19___ г.\r\nРуководитель НОК МИБП -\r\nдиректор ГИСК\r\nим.Л.А.Тарасевича ________________ Ф.,И.,О.\r\n                                      _______________ 19___ г.\r\nРуководитель лаборатории\r\nстандартизации НТД ________________ Ф.,И.,О.\r\n                                      _______________ 19___ г.\r\nРуководитель Фармакопейного\r\nгосударственного комитета ___________ Ф.,И.,О.\r\n                                      _______________ 19___ г.\r\nГлавный ученый секретарь\r\nФармакопейного государственного\r\nкомитета ___________________________ Ф.,И.,О.\r\n                                      _______________ 19___ г.\r\n \r\n 

Приложение 13

ФС 42(наименование препарата на русском языке)

Изменение N

Срок введения изменения с _____________________ 19____ г.

Приложение 14

1. Краткое описание технологии изготовления препарата.

2. На каком количестве изученных экспериментально-производственных серий препарата разработан проект ВФС (или количестве производственных серий для ФС), какая организация изготовила эти серии, объем каждой серии.

3. Отличие показателей качества и методов контроля, приведенных в авторском проекте ВФС, от показателей качества и методов контроля в представленном на утверждение стандарте. Обоснование их изменения. Аналогичные отличия в ФС, по сравнению с ВФС.

4. Сравнение качества лабораторных и экспериментально-производственных серий препарата для ВФС, экспериментально-производственных и производственных серий для ФС.

5. Обоснование срока годности препарата, указанного в проекте ВФС и ФС (в виде таблицы, в которой приведены качественные характеристики препарата в процессе его хранения, превышающем срок годности).

6. Перечень всех химических веществ, используемых в технологии производства препарата.

7. Перечень всех химических и биологических веществ, добавляемых в препарат или содержащихся в готовом препарате, с указанием их абсолютного количества в 1 мл или 1 дозе препарата. Кем, когда, в каком количестве и каким путем разрешено применение в медицинской практике каждого из указанных веществ.

8. Таблица сравнения показателей, характеризующих качество препарата, предусмотренных проектом ВФС или ФС, с аналогичными показателями препаратов, применяемых в настоящее время в нашей стране и за рубежом; требование зарубежных фармакопей и рекомендаций ВОЗ.

9. Список литературы, используемой при разработке проекта ВФС или ФС.

Приложение 15

1. Краткое описание технологии изготовления препарата.

2. На каком количестве изученных лабораторных серий препарата разработан проект ВФС (или количестве производственных серий для ФС), какая организация изготовила эти серии, объем каждой серии.

3. Отличие показателей качества и методов контроля, приведенных в проекте ВФС, от показателей качества и методов контроля, указанных в техническом задании. Обоснование их изменения. Аналогичные отличия в ФС по сравнению с ВФС.

4. Обоснование срока годности препарата, указанного в проекте ВФС или ФС (в виде таблицы, в которой приведены качественные характеристики препарата в процессе его хранения, превышающем срок годности).

5. Таблица сравнения показателей, характеризующих качество препарата, предусмотренных проектом ВФС или ФС, с аналогичными показателями препаратов, применяемых в настоящее время в нашей стране и за рубежом; требования зарубежных фармакопей и рекомендаций ВОЗ.

6. Список литературы, использованной при разработке проекта ВФС.