Последнее обновление: 17.05.2024
Законодательная база Российской Федерации
8 (800) 350-23-61
Бесплатная горячая линия юридической помощи
- Главная
- "ГОСУДАРСТВЕННЫЕ ИСПЫТАНИЯ И РЕГИСТРАЦИЯ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ. САНИТАРНЫЕ ПРАВИЛА. СП 3.3.2.561-96" (утв. Постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 31.10.96 N 33)
1. Методы доклинического испытания иммунологической безопасности вакцин
1.1. Определение фагоцитарной активности макрофагов.
Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) выделяют асептически от 3-5 мышей опытной и контрольной групп и помещают в среду 199, содержащую 5 ME гепарина в 1 мл, в пробирки, стоящие на льду. Не используют экссудаты, содержащие эритроциты. После осаждения (150 g, 10 мин) клетки ресуспендируют в среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота с антибиотиками (100 ед/мл). Концентрацию клеток доводят до 1,0-2,0х106 кл/мл и суспензию разливают по 2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в термостат при температуре (37+-2)°С с содержанием 5% СО2. Через 60 мин смывают неприлипшие клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей среды и оставляют на 18-24 ч в термостате с 5-7% СО2 при температуре (37+-2)°С.
Клетки для исследования фагоцитоза можно получать также на половинках покровных стекол, помещенных в пробирки с 1,5+-2 мл КПЭ.
Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана, дрожжеподобные грибы Candida albicans или лабораторный штамм Staphylococeus (N 9198) или любые другие микробные клетки.
Эритроциты барана (ЭБ) *(1) трижды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия, осаждая на центрифуге при 800 g в течение 5 мин. Готовят 0,5%-ную взвесь ЭБ на среде 199.
Суточные культуры живых или убитых прогреванием при температуре (90+2) градусов С в течение 45-60 мин микроорганизмов отмывают путем центрифугирования не менее 3-х раз 0,9%-ным раствором хлорида натрия, ресуспендируют в нем и определяют концентрацию суспензии по стандарту оптической мутности. Взвесь разводят средой 199 до концентрации, соответствующей предварительно установленному соотношению (1,0-2,0(9) кл/мл).
В чашки Петри, содержащие КПЗ, наливают 1 мл свежей среды и вносят по 1 мл взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов. Через 30-60 мин чашки ополаскивают холодным раствором Хенкса, подсушивают и фиксируют 10 мин метанолом. Окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимзе.
Учет результатов. Просматривают не менее 200 клеток, подсчитывая фагоцитирующие клетки и количество содержащихся в них ЭБ или микробов.
Результаты выражают процентом фагоцитирующих клеток (ПФ) и фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется количеством частиц на один фагоцит.
1.2. Исследование селезенки.
После забоя животных во время вскрытия проводят макроскопическое и микроскопическое изучение селезенки, оценивают степень ее кровенаполнения и отека, измеряют величину и массу органа.
1.3. Исследование клеточного состава и пролиферативной
активности клеток селезенки.
Из селезенки готовят взвесь клеток, 0,2 мл такой взвеси подвергают центрифугированию, осадок разводят в 0,2 мл цельной декомплементированной сыворотки крови, ресуспендируют, подвергают повторному центрифугированию и из осадков готовят мазок на предметном стекле, аналогично мазку крови. Далее мазок высушивают, фиксируют 10-15 мин в метаноле и окрашивают по методу Романовского-Гимза.
Морфологическое исследование проводят при увеличении 100х10 (масляная иммерсия), подсчитывая в 2000 клеток % клеток разных рядов кроветворения и среди них % делящихся клеток (митозов).
Кроме того, в селезенке оценивают состояние белой и красной пульпы: выраженность лимфоидных фолликулов, их величину, активность реактивных центров, а также Т- и В-зависимых зон, развитие гиперплазии последней, степень миэлоза пульпы селезенки, определяют характер восстановительных процессов.
1.4. Получение взвеси клеток селезенки.
Мышей забивают с помощью хлороформа. Извлекают селезенку, взвешивают ее на торсионных весах, осторожным раздавливанием в стеклянном гомогенизаторе готовят взвесь клеток из расчета 1 мл среды 199 на 50 мг ткани селезенки. Полученную суспензию фильтруют через 2 слоя капроновой сетки.
0,5 мл взвеси спленоцитов отмывают 5 мл среды 199 путем центрифугирования в течение 10 мин при 150 g, надосадок удаляют, а осадок разводят средой 199 с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед/мл) до исходной концентрации. Необходимо подчеркнуть, что клетки селезенки каждой мыши следует использовать индивидуально, не создавая клеточных цулов. Для сравнения результатов следует использовать среднегрупповые величины.
Примечание. Для пересчета G на число оборотов, соответствующее данной центробежной силе, следует пользоваться формулой:
R - радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл-верографина с клетками, см;
G - центробежная сила.
1.5. Определение количества Т-клеток (цитотоксический тест).
Принцип метода заключается в том, что антитела, направленные против различных лимфоцитарных антигенов, фиксируются специфически на клетках, содержащих эти антигены, и в присутствии комплемента нарушают целость клеточной мембраны. Образовавшиеся отверстия в мембране лимфоцитов позволяют прибавленному к взвеси красителю (трипановый синий) проникнуть внутрь клетки и окрашивать ее. Жизнеспособные с интактной мембраной клетки этим красителем не окрашиваются.
Коммерческую поликлональную сыворотку против Т-лимфоцитов мыши разводят средой 199 до рабочей концентрации, указанной на этикетке. В центрифужной пробирке или в лунке панели смешивают 60 мкл сыворотки, 20 мкл исследуемой взвеси лимфоцитов (концентрация 10(7) кл/мл) и 20 мкл комплемента кролика в разведении 1:3. В контрольные пробирки или лунки вносят 20 мкл взвеси лимфоцитов (концентрация 10(7) кл/мл), 20 мкл комплемента и 60 мкл среды 199. Смеси перемешивают и инкубируют в термостате при температуре (37+-2)°С 25-30 мин. В каждую пробирку или лунку добавляют по 100 мкл раствора трипанового синего*(2). Через 30-60 сек помещают взвесь из лунки в счетную камеру.
Учет результатов. Определяют число погибших клеток, вычисляют их процент от общего количества клеток в препарате, подсчитывают цитотоксический индекс (ЦТИ) по формуле:
Оценка результатов. ЦТИ Указывает, какой процент клеток среди исследуемой взвеси несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит к данной популяции. Так, например, если при исследовании клеток селезенки ЦТИ составил 32%, можно заключить, что 32 % этих клеток составляют Т-лимфоциты.
1.6. Определение количества В-лимфоцитов (цитотоксический тест).
Общее количество всех В-клеток определяется в цитотоксическом тесте с коммерческой поликлональной специфической сывороткой против В-лимфоцитов мыши. Постановка теста аналогична постановке цитотоксического теста с анти-Т-сывороткой.
1.7. Определение гиперчувствительности немедленного типа: феномен Овери у морских свинок.
Феномен Овери - кожная анафилаксия, при которой происходит быстрое повышение проницаемости капилляров кожи под влиянием реакции антиген-антитело.
Опыты проводят на белобоких морских свинках массой 200-300 г.
Исследуемую вакцину вводят по следующей схеме. Сенсибилизирующие инъекции вакцины: первая подкожно, две последующие с интервалом в 1 сут. - внутримышечно в область бедра. Доза препарата, вводимого на одну инъекцию, равна дозе, предлагаемой для введения человеку. Разрешающую инъекцию проводят внутрикожно на 18-25 день после первой сенсибилизирующей инъекции. Для разрешающей инъекции вводят препарат в дозе, равной или превышающей в 5-10 раз однократную сенсибилизирующую дозу.
Контролем служат несенсибилизированные животные, получившие только разрешающую инъекцию вакцины.
Через 5-7 мин опытной и контрольной группе внутрисердечно или внутривенно вводят 0,5-1,0 мл 1%-ного водного раствора голубого Эванса.
Учет результатов. Через 20 мин в опытной группе, в случае развития анафилаксии от препарата, на месте введения разрешающей его дозы появляется синее пятно. У животных контрольной группы пятно не должно появляться.
- Главная
- "ГОСУДАРСТВЕННЫЕ ИСПЫТАНИЯ И РЕГИСТРАЦИЯ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ. САНИТАРНЫЕ ПРАВИЛА. СП 3.3.2.561-96" (утв. Постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 31.10.96 N 33)