Законодательная база Российской Федерации

"ГОСУДАРСТВЕННЫЕ ИСПЫТАНИЯ И РЕГИСТРАЦИЯ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ. САНИТАРНЫЕ ПРАВИЛА. СП 3.3.2.561-96" (утв. Постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 31.10.96 N 33)

Развитие специфического иммунного ответа при вакцинации сопровождается неспецифическими изменениями иммунной системы, которые могут привести к ослаблению устойчивости организма к другим инфекционным агентам, иммунодефицитным состояниям и аллергии. В связи с этим общая схема испытания новых вакцин предусматривает изучение иммунологической безопасности этих препаратов. Изучение проводится на доклиническом и клиническом уровнях.

Лабораторно-экспериментальное (доклиническое) изучение включает оценку состояния иммунной системы экспериментальных животных после введения им испытуемой вакцины (исследование селезенки, численности и функции иммунокомпетентных клеток); исследование резистентности к возбудителям других инфекций; изучение аллергизирующего действия вакцины и аутоиммунных реакций на вакцинацию.

Клиническое изучение иммунологической безопасности осуществляется в два этапа. В рамках первого этапа на ограниченной группе людей проводятся клинико-лабораторные исследования, которые включают: оценку иммунного статуса, выявление изменений иммунологической реактивности на неродственные инфекционные агенты, определение аллергических и аутоиммунных реакций. На втором этапе клинических испытаний в контролируемых полевых условиях у вакцинированных выявляются иммунозависимые заболевания, развившиеся в результате неспецифических изменений иммунной системы после вакцинации.

1.1. Определение фагоцитарной активности макрофагов.

Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) выделяют асептически от 3-5 мышей опытной и контрольной групп и помещают в среду 199, содержащую 5 ME гепарина в 1 мл, в пробирки, стоящие на льду. Не используют экссудаты, содержащие эритроциты. После осаждения (150 g, 10 мин) клетки ресуспендируют в среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота с антибиотиками (100 ед/мл). Концентрацию клеток доводят до 1,0-2,0х106 кл/мл и суспензию разливают по 2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в термостат при температуре (37+-2)°С с содержанием 5% СО2. Через 60 мин смывают неприлипшие клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей среды и оставляют на 18-24 ч в термостате с 5-7% СО2 при температуре (37+-2)°С.

Клетки для исследования фагоцитоза можно получать также на половинках покровных стекол, помещенных в пробирки с 1,5+-2 мл КПЭ.

Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана, дрожжеподобные грибы Candida albicans или лабораторный штамм Staphylococeus (N 9198) или любые другие микробные клетки.

Эритроциты барана (ЭБ) *(1) трижды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия, осаждая на центрифуге при 800 g в течение 5 мин. Готовят 0,5%-ную взвесь ЭБ на среде 199.

Суточные культуры живых или убитых прогреванием при температуре (90+2) градусов С в течение 45-60 мин микроорганизмов отмывают путем центрифугирования не менее 3-х раз 0,9%-ным раствором хлорида натрия, ресуспендируют в нем и определяют концентрацию суспензии по стандарту оптической мутности. Взвесь разводят средой 199 до концентрации, соответствующей предварительно установленному соотношению (1,0-2,0(9) кл/мл).

В чашки Петри, содержащие КПЗ, наливают 1 мл свежей среды и вносят по 1 мл взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов. Через 30-60 мин чашки ополаскивают холодным раствором Хенкса, подсушивают и фиксируют 10 мин метанолом. Окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимзе.

Учет результатов. Просматривают не менее 200 клеток, подсчитывая фагоцитирующие клетки и количество содержащихся в них ЭБ или микробов.

Результаты выражают процентом фагоцитирующих клеток (ПФ) и фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется количеством частиц на один фагоцит.

1.2. Исследование селезенки.

После забоя животных во время вскрытия проводят макроскопическое и микроскопическое изучение селезенки, оценивают степень ее кровенаполнения и отека, измеряют величину и массу органа.

1.3. Исследование клеточного состава и пролиферативной
активности клеток селезенки.

Из селезенки готовят взвесь клеток, 0,2 мл такой взвеси подвергают центрифугированию, осадок разводят в 0,2 мл цельной декомплементированной сыворотки крови, ресуспендируют, подвергают повторному центрифугированию и из осадков готовят мазок на предметном стекле, аналогично мазку крови. Далее мазок высушивают, фиксируют 10-15 мин в метаноле и окрашивают по методу Романовского-Гимза.

Морфологическое исследование проводят при увеличении 100х10 (масляная иммерсия), подсчитывая в 2000 клеток % клеток разных рядов кроветворения и среди них % делящихся клеток (митозов).

Кроме того, в селезенке оценивают состояние белой и красной пульпы: выраженность лимфоидных фолликулов, их величину, активность реактивных центров, а также Т- и В-зависимых зон, развитие гиперплазии последней, степень миэлоза пульпы селезенки, определяют характер восстановительных процессов.

1.4. Получение взвеси клеток селезенки.

Мышей забивают с помощью хлороформа. Извлекают селезенку, взвешивают ее на торсионных весах, осторожным раздавливанием в стеклянном гомогенизаторе готовят взвесь клеток из расчета 1 мл среды 199 на 50 мг ткани селезенки. Полученную суспензию фильтруют через 2 слоя капроновой сетки.

0,5 мл взвеси спленоцитов отмывают 5 мл среды 199 путем центрифугирования в течение 10 мин при 150 g, надосадок удаляют, а осадок разводят средой 199 с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед/мл) до исходной концентрации. Необходимо подчеркнуть, что клетки селезенки каждой мыши следует использовать индивидуально, не создавая клеточных цулов. Для сравнения результатов следует использовать среднегрупповые величины.

Примечание. Для пересчета G на число оборотов, соответствующее данной центробежной силе, следует пользоваться формулой:

где:

N - число оборотов в мин;

R - радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл-верографина с клетками, см;

G - центробежная сила.

1.5. Определение количества Т-клеток (цитотоксический тест).

Принцип метода заключается в том, что антитела, направленные против различных лимфоцитарных антигенов, фиксируются специфически на клетках, содержащих эти антигены, и в присутствии комплемента нарушают целость клеточной мембраны. Образовавшиеся отверстия в мембране лимфоцитов позволяют прибавленному к взвеси красителю (трипановый синий) проникнуть внутрь клетки и окрашивать ее. Жизнеспособные с интактной мембраной клетки этим красителем не окрашиваются.

Коммерческую поликлональную сыворотку против Т-лимфоцитов мыши разводят средой 199 до рабочей концентрации, указанной на этикетке. В центрифужной пробирке или в лунке панели смешивают 60 мкл сыворотки, 20 мкл исследуемой взвеси лимфоцитов (концентрация 10(7) кл/мл) и 20 мкл комплемента кролика в разведении 1:3. В контрольные пробирки или лунки вносят 20 мкл взвеси лимфоцитов (концентрация 10(7) кл/мл), 20 мкл комплемента и 60 мкл среды 199. Смеси перемешивают и инкубируют в термостате при температуре (37+-2)°С 25-30 мин. В каждую пробирку или лунку добавляют по 100 мкл раствора трипанового синего*(2). Через 30-60 сек помещают взвесь из лунки в счетную камеру.

Учет результатов. Определяют число погибших клеток, вычисляют их процент от общего количества клеток в препарате, подсчитывают цитотоксический индекс (ЦТИ) по формуле:

Оценка результатов. ЦТИ Указывает, какой процент клеток среди исследуемой взвеси несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит к данной популяции. Так, например, если при исследовании клеток селезенки ЦТИ составил 32%, можно заключить, что 32 % этих клеток составляют Т-лимфоциты.

1.6. Определение количества В-лимфоцитов (цитотоксический тест).

Общее количество всех В-клеток определяется в цитотоксическом тесте с коммерческой поликлональной специфической сывороткой против В-лимфоцитов мыши. Постановка теста аналогична постановке цитотоксического теста с анти-Т-сывороткой.

1.7. Определение гиперчувствительности немедленного типа: феномен Овери у морских свинок.

Феномен Овери - кожная анафилаксия, при которой происходит быстрое повышение проницаемости капилляров кожи под влиянием реакции антиген-антитело.

Опыты проводят на белобоких морских свинках массой 200-300 г.

Исследуемую вакцину вводят по следующей схеме. Сенсибилизирующие инъекции вакцины: первая подкожно, две последующие с интервалом в 1 сут. - внутримышечно в область бедра. Доза препарата, вводимого на одну инъекцию, равна дозе, предлагаемой для введения человеку. Разрешающую инъекцию проводят внутрикожно на 18-25 день после первой сенсибилизирующей инъекции. Для разрешающей инъекции вводят препарат в дозе, равной или превышающей в 5-10 раз однократную сенсибилизирующую дозу.

Контролем служат несенсибилизированные животные, получившие только разрешающую инъекцию вакцины.

Через 5-7 мин опытной и контрольной группе внутрисердечно или внутривенно вводят 0,5-1,0 мл 1%-ного водного раствора голубого Эванса.

Учет результатов. Через 20 мин в опытной группе, в случае развития анафилаксии от препарата, на месте введения разрешающей его дозы появляется синее пятно. У животных контрольной группы пятно не должно появляться.

2.1. Методы получения материалов для исследования иммунного статуса.

2.1.1. Взятие крови.

Кровь у обследуемого берут в асептических условиях иглой из локтевой вены в две стерильные бактериологические пробирки:

10,0 мл крови - в пробирку с гепарином *(3) (25 ед/мл крови) и 5,0 мл крови - в сухую пробирку для получения сыворотки. Кровь с гепарином хранят при 6-8 градусов С не более 4 ч, длительность хранения должна быть стандартной для всего цикла исследований.

2.1.2. Выделение фракции лимфоцитов для изучения их популяционного состава.

В бактериологические пробирки разливают забуференный 0,9%-ный раствор хлорида натрия рН 7,2-7,3 *(4) (или раствор Хенкса, или среду 199) по 2,0 мл, добавляют равный объем гепаринизированной крови. Разведенную таким образом вдвое кровь отбирают пастеровской пипеткой и наслаивают на смесь фиколл-верографина *(5) (1,5 мл). Соотношение объема смеси к объему разведенной крови может составлять 1:2-1:5. Между кровью и фиколл-верографином определяется четкая граница, одного, уже в первые минуты после наслаивания, эритроциты крупными хлопьями начинают опускаться на дно емкости.

Пробирки с кровью и градиентом плотности центрифугируют при 400 g 30-40 мин.

В результате центрифугирования образуются фракции: 1-я сверху - слегка опалесцирующая - плазма крови и буферный раствор; 2-я - белый диск, содержащий мононуклеарные клетки крови; 3-я - прозрачная - градиент фиколл-верографина; 4-я - осадок эритроцитов и гранулоцитов.

Слой мононуклеаров пастеровской пипеткой отбирают в центрифужную пробирку. Мононуклеарные клетки три раза отмывают тем же буферным раствором путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок отмытых лимфоцитов суспендируют в 0,5 мл буферного раствора. Жизнеспособность клеток определяют окрашиванием трипановым синим (см.п.1.5). Взвесь лимфоцитов готовят на среде 199, концентрация клеток 2х10(6) кл/мл. Выход лимфоцитов из 1,0 мл цельной крови составляет 1-1,5х10(6) клеток. Исследования проводят в тот же день.

2.1.3. Получение сыворотки крови.

Кровь, помещенную в пробирки (п.2.1.1), инкубируют в термостате при (37+-2)°С 1 ч. После обведения сгустка пастеровской пипеткой пробирки помещают в холодильник (6-8°С) на 18 ч. Затем образовавшуюся сыворотку переносят в стерильные пробирки и хранят до исследования в холодильнике при температуре минус (20+-2)24°С.

2.2. Методы выявления аллергизирующего действия вакцин, развития аутоиммунных реакций.

2.2.1. Определение общего иммуноглобулина Е человека (Ig-E) в сыворотке крови (ИФА).

Используют иммуноферментные Ig-Е-тест-системы. Постановку реакции осуществляют согласно инструкции к набору, в которой указаны методы приготовления всех необходимых растворов. Оценку результатов проводят на спектрофотометре типа Multiscan при соответствующей длине волны.

У взрослых нормальное содержание Ig-E в пределах 100- 130 кЕ/л *(6). Содержание Ig-E у вакцинированных выше 150 кЕ/л может свидетельствовать об аллергизирующем действии вакцины.

Определение аутоантител на тканевые аутоантигены (ИФА).

Для определения в сыворотках крови привитых аутоантител к нативной и денатурированной ДНК используют коммерческие тест-системы. Постановку реакции осуществляют согласно инструкции к набору. При работе используют спектрофотометр типа Multiscan.

Учет результатов. Вычисляют индекс (И) иммуноферментной реакции. Он равен частному от деления оптической плотности (ОП) положительной сыворотки на ОП отрицательной сыворотки и частному от деления ОП анализируемой сыворотки на ОП отрицательной сыворотки.

Оценка результатов. Если частное от деления ОП анализируемой сыворотки на ОП отрицательной сыворотки >1,1 (при анализе антител к нативной ДНК) и >1,3 (при анализе антител к денатурированной ДНК), то иммуноферментную реакцию считают положительной. При наличии И >=2 анализ свидетельствует о появлении риска развития аутоиммунных реакций.

2.3. Изучение иммунного статуса.

2.3.1. Определение количества лейкоцитов в крови.

Для определения количества лейкоцитов 0,1 мл крови вносят в пробирку с 1,9 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты. Затем каплю содержимого пробирки помещают в камеру Горяева. Под световым микроскопом подсчитывают количество ядросодержащих клеток в 100 квадратах (или 25 "окнах"). Исходя из полученного числа клеток, вычисляют количество лейкоцитов в 1 мл крови.

2.3.2. Определение лейкоцитарной формулы.

Готовят мазок крови на предметном стекле, высушивают его на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в этиловом (10 мин) или метиловом (4 мин) спирте. Фиксированный мазок красят азур-эозином по Романовскому-Гимзе. Мазки просматривают в световом микроскопе под иммерсией. На каждом стекле просчитывают не менее 200 клеток. Исходя из полученных результатов вычисляют процентное содержание нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и других клеток белой крови. Затем подсчитывают их абсолютное количество в 1 л крови.

2.3.3. Определение фагоцитарной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов.

В силиконированной *(7) стерильной пробирке смешивают 0,2 мл гепаринизированной крови (25 ед/мл крови) и 0,1 мл взвеси культуры микроорганизма в концентрации 1-2х10(9) кл/мл. Смесь клеток инкубируют в течение 1 ч при температуре (37+-2)°С и затем готовят мазки на предметном стекле. Приготовленные таким образом препараты высушивают на воздухе при температуре 18-20°С, фиксируют этиловым спиртом или метанолом в течение (10+-1) мин и окрашивают 0,5%-ным раствором метиленового синего или раствором метилового зеленого пиронина *(8) - в течение 60 мин. После окрашивания мазки ополаскивают водой, промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе при температуре (18-20)°С. Работу по окрашиванию препарата проводят в лабораторном химическом шкафу с вытяжкой.

Учет результатов. В мазке под микроскопом с масляной иммерсией сосчитывают число клеток с фагоцитированным материалом на 200-300 полиморфноядерных лейкоцитов и количество поглощенных клеток в каждом лейкоците. Оценку фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови проводят по следующим показателям процент фагоцитоза (ПФ) - относительное количество лейкоцитов крови, обладающих фагоцитарной активностью, выраженной в процентах; фагоцитарное число (ФЧ) - количество поглощенных клеток из расчета на один лейкоцит; абсолютный фагоцитарный показатель (АФП) - суммарный показатель активности полиморфноядерных лейкоцитов крови, рассчитывают по формуле:

АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл х ФЧ

Подсчитывают количество полиморфноядерных лейкоцитов в 1 мкл крови, затем определяют количество фагоцитирующих лейкоцитов в 1 мкл крови.

Пример: общее количество лейкоцитов 1 мкл крови - 5000 с содержанием полиморфноядерных лейкоцитов - 60%

ПФ - 80%

ФЧ - 5

а) общее число лейкоцитов 5000 - 100%

полиморфноядерных лейкоцитов Х - 60 %

полиморфноядерных лейкоцитов = 3000

б) полиморфноядерных лейкоцитов 3000 - 100%

фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов Х - 80%

фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов = 2400

в) АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл крови х ФЧ

АФП=2400х5=1200

Приготовление реактивов (см. сноски *(7) и *(8) на предыдущей странице).

2.3.4. Определение численности Т-клеток, зрелых Т-клеток, Т-супрессоров, Т-хелперов, В-клеток, киллеров методом непрямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами.

Для определения субнопуляций Т-клеток у человека можно использовать метод розеткообразования и метод иммунофлюоресценции с моноклональными антителами. Последний является более точным.

Принцип метода основан на том, что антилимфоцитарпые мышиные моноклональные антитела присоединяются к соответствующим антигенным маркерам поверхности лимфоцита, а участки их фиксации выявляются при помощи антител к lg мыши, меченых ФИТЦ. Количество клеток, на поверхности которых обнаруживается свечение, характеризует численность субпопуляций, против маркеров которой были получены соответствующие моноклональные антитела (МкА). Постановку реакции осуществляют согласно инструкции к набору моноклональных антител.

На стадиях доклинических и клинических испытаний кроме описанных выше методов рекомендуется проводить дополнительные исследования состояния иммунной системы, которые не являются обязательными и выполняются в зависимости от результатов иммунологических исследований первого уровня. Дополнительные исследования включают: реакцию спонтанной бластгрансформации лимфоцитов, реакцию бласттрансформации лимфоцитов под влиянием Ти В-митогенов (ФГА, Кон А, ЛПС), определение функциональной активности регуляторных Т-лимфоцитов (Т-хелперов, Т-супрессоров), реакцию торможения миграции макрофагов и лейкоцитов, пассивную кожную анафилаксию в опытах на морских свинках и мышах, индукцию замедленной гиперчувствительности и экспериментального аллергического энцефаломиелита на животных, определение уровня различных цитокинов, оценку клеточного иммунитета у людей по кожным реакциям замедленной гиперчувствительности на РРД, кандидин, трихофитин и пр. Для проведения дополнительных исследований можно пользоваться методиками, описанными в различных методических руководствах по иммунологии.

*(1) Кровь барана, взятую в консервант крови, можно хранить до 10 сут. при 6-8°С.

*(2) Приготовление раствора трипанового синего. Для приготовления 0,5%-ного раствора 500 мг красителя растворяют в 100 мл горячего (80-90°С) 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Раствор перемешивают 10 мин на магнитной мешалке и фильтруют через фильтровальную бумагу. Готовый раствор хранят в плотно закрытом сосуде при температуре 10-20°С. Непосредственно перед употреблением раствор красителя фильтруют через тонкий слой ваты, чтобы избавиться от осадка.

*(3) Приготовление гепарина. Сухой гепарин растворяют в дистиллированной воде в объеме, указанном на этикетке, раствор стерилизуют фильтрованием через фильтры Миллипор и хранят при 6-8 градусов С в течение одного цикла исследований. Из основного раствора гепарина готовят его рабочий раствор на среде 199 с таким расчетом, чтобы в 0,5 мл содержалось 250 ед. активности.

*(4) Приготовление 0,9%-ного раствора хлорида натрия буферного (рН 7,2). К 7,0 хлорида натрия добавляют 2,0 г двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,3 г однозамещенного фосфорнокислого калия, доводят до 1000 мл ТДВ, рН 7,2.

*(5) Приготовление смеси фиколл-верографина (плотность 1,077). Смесь готовят на тридистиллированной автоклавированной воде (ТДВ): а) Из 76%-ного раствора верографина готовят 33,9%-ный раствор (плотность 1,200); к 33,9 мл 76%-ного верографина добавляют 42,1 мл ТДВ; б) 9%-ный раствор фиколла (плотность 1,025): к 10,8 г фиколла добавляют 109,2 мл ТДВ (подогретой до 30-40 грудусов С); в) соединяют 7 частей раствора верографина и 16 частей раствора фиколла: к 52,5 мл верографина добавляют 120 мл фиколла. Плотность смеси измеряют ареометром, плотность смеси должна быть 1,077. Смесь хранят в темном флаконе в холодильнике при 6-8°С две недели.

*(6) кЕ/л (система СИ) = Е/мл

*(7) Силиконирование посуды. Чистые пробирки ополаскивают силиконом, помещают в фильтровальную бумагу вверх дном для того, чтобы стекли остатки силикона из пробирок, выдерживают в таких условиях в течение 1 ч, затем помещают их в сушильный шкаф на 1,5 ч при температуре 120-140°С, затем промывают пробирки дистиллированной водой и вновь выдерживают в сушильном шкафу в указанном режиме. Работу по силиконированию посуды проводят в лабораторном химическом шкафу с вытяжкой.

*(8) Приготовление краски метиловый-зеленый пиронин. Предварительно готовят растворы "а" и "б", перед использованием смешивают указанные растворы в соотношении 1:1. Раствор "а" состоит из смеси следующего состава: 17,5 мл 5%-ного водного раствора пиронина, 10 мл 2%-ного раствора метилового зеленого (метиловый зеленый должен быть предварительно промыт хлороформом и высушен на воздухе), 250 мл дистиллированной воды. Раствор "б" - ацетатный буферный раствор в концентрации 0,2 моль/м, рН 4,8.

Приготовление ацетатного буферного раствора 0,2 М рН 4,8. К 120 мл раствора ацетата натрия в концентрации 0,1 моль/м3 (16,3 г ацетата натрия на 1 л дистиллированной воды) доливают около 80 мл раствора уксусной кислоты той же концентрации (4,61 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л дистиллированной воды), доводят рН раствора до 4,8.