Законодательная база Российской Федерации

"ГОСУДАРСТВЕННЫЕ ИСПЫТАНИЯ И РЕГИСТРАЦИЯ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ. САНИТАРНЫЕ ПРАВИЛА. СП 3.3.2.561-96" (утв. Постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 31.10.96 N 33)

2.1. Методы получения материалов для исследования иммунного статуса.

2.1.1. Взятие крови.

Кровь у обследуемого берут в асептических условиях иглой из локтевой вены в две стерильные бактериологические пробирки:

10,0 мл крови - в пробирку с гепарином *(3) (25 ед/мл крови) и 5,0 мл крови - в сухую пробирку для получения сыворотки. Кровь с гепарином хранят при 6-8 градусов С не более 4 ч, длительность хранения должна быть стандартной для всего цикла исследований.

2.1.2. Выделение фракции лимфоцитов для изучения их популяционного состава.

В бактериологические пробирки разливают забуференный 0,9%-ный раствор хлорида натрия рН 7,2-7,3 *(4) (или раствор Хенкса, или среду 199) по 2,0 мл, добавляют равный объем гепаринизированной крови. Разведенную таким образом вдвое кровь отбирают пастеровской пипеткой и наслаивают на смесь фиколл-верографина *(5) (1,5 мл). Соотношение объема смеси к объему разведенной крови может составлять 1:2-1:5. Между кровью и фиколл-верографином определяется четкая граница, одного, уже в первые минуты после наслаивания, эритроциты крупными хлопьями начинают опускаться на дно емкости.

Пробирки с кровью и градиентом плотности центрифугируют при 400 g 30-40 мин.

В результате центрифугирования образуются фракции: 1-я сверху - слегка опалесцирующая - плазма крови и буферный раствор; 2-я - белый диск, содержащий мононуклеарные клетки крови; 3-я - прозрачная - градиент фиколл-верографина; 4-я - осадок эритроцитов и гранулоцитов.

Слой мононуклеаров пастеровской пипеткой отбирают в центрифужную пробирку. Мононуклеарные клетки три раза отмывают тем же буферным раствором путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок отмытых лимфоцитов суспендируют в 0,5 мл буферного раствора. Жизнеспособность клеток определяют окрашиванием трипановым синим (см.п.1.5). Взвесь лимфоцитов готовят на среде 199, концентрация клеток 2х10(6) кл/мл. Выход лимфоцитов из 1,0 мл цельной крови составляет 1-1,5х10(6) клеток. Исследования проводят в тот же день.

2.1.3. Получение сыворотки крови.

Кровь, помещенную в пробирки (п.2.1.1), инкубируют в термостате при (37+-2)°С 1 ч. После обведения сгустка пастеровской пипеткой пробирки помещают в холодильник (6-8°С) на 18 ч. Затем образовавшуюся сыворотку переносят в стерильные пробирки и хранят до исследования в холодильнике при температуре минус (20+-2)24°С.

2.2. Методы выявления аллергизирующего действия вакцин, развития аутоиммунных реакций.

2.2.1. Определение общего иммуноглобулина Е человека (Ig-E) в сыворотке крови (ИФА).

Используют иммуноферментные Ig-Е-тест-системы. Постановку реакции осуществляют согласно инструкции к набору, в которой указаны методы приготовления всех необходимых растворов. Оценку результатов проводят на спектрофотометре типа Multiscan при соответствующей длине волны.

У взрослых нормальное содержание Ig-E в пределах 100- 130 кЕ/л *(6). Содержание Ig-E у вакцинированных выше 150 кЕ/л может свидетельствовать об аллергизирующем действии вакцины.

Определение аутоантител на тканевые аутоантигены (ИФА).

Для определения в сыворотках крови привитых аутоантител к нативной и денатурированной ДНК используют коммерческие тест-системы. Постановку реакции осуществляют согласно инструкции к набору. При работе используют спектрофотометр типа Multiscan.

Учет результатов. Вычисляют индекс (И) иммуноферментной реакции. Он равен частному от деления оптической плотности (ОП) положительной сыворотки на ОП отрицательной сыворотки и частному от деления ОП анализируемой сыворотки на ОП отрицательной сыворотки.

Оценка результатов. Если частное от деления ОП анализируемой сыворотки на ОП отрицательной сыворотки >1,1 (при анализе антител к нативной ДНК) и >1,3 (при анализе антител к денатурированной ДНК), то иммуноферментную реакцию считают положительной. При наличии И >=2 анализ свидетельствует о появлении риска развития аутоиммунных реакций.

2.3. Изучение иммунного статуса.

2.3.1. Определение количества лейкоцитов в крови.

Для определения количества лейкоцитов 0,1 мл крови вносят в пробирку с 1,9 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты. Затем каплю содержимого пробирки помещают в камеру Горяева. Под световым микроскопом подсчитывают количество ядросодержащих клеток в 100 квадратах (или 25 "окнах"). Исходя из полученного числа клеток, вычисляют количество лейкоцитов в 1 мл крови.

2.3.2. Определение лейкоцитарной формулы.

Готовят мазок крови на предметном стекле, высушивают его на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в этиловом (10 мин) или метиловом (4 мин) спирте. Фиксированный мазок красят азур-эозином по Романовскому-Гимзе. Мазки просматривают в световом микроскопе под иммерсией. На каждом стекле просчитывают не менее 200 клеток. Исходя из полученных результатов вычисляют процентное содержание нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и других клеток белой крови. Затем подсчитывают их абсолютное количество в 1 л крови.

2.3.3. Определение фагоцитарной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов.

В силиконированной *(7) стерильной пробирке смешивают 0,2 мл гепаринизированной крови (25 ед/мл крови) и 0,1 мл взвеси культуры микроорганизма в концентрации 1-2х10(9) кл/мл. Смесь клеток инкубируют в течение 1 ч при температуре (37+-2)°С и затем готовят мазки на предметном стекле. Приготовленные таким образом препараты высушивают на воздухе при температуре 18-20°С, фиксируют этиловым спиртом или метанолом в течение (10+-1) мин и окрашивают 0,5%-ным раствором метиленового синего или раствором метилового зеленого пиронина *(8) - в течение 60 мин. После окрашивания мазки ополаскивают водой, промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе при температуре (18-20)°С. Работу по окрашиванию препарата проводят в лабораторном химическом шкафу с вытяжкой.

Учет результатов. В мазке под микроскопом с масляной иммерсией сосчитывают число клеток с фагоцитированным материалом на 200-300 полиморфноядерных лейкоцитов и количество поглощенных клеток в каждом лейкоците. Оценку фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови проводят по следующим показателям процент фагоцитоза (ПФ) - относительное количество лейкоцитов крови, обладающих фагоцитарной активностью, выраженной в процентах; фагоцитарное число (ФЧ) - количество поглощенных клеток из расчета на один лейкоцит; абсолютный фагоцитарный показатель (АФП) - суммарный показатель активности полиморфноядерных лейкоцитов крови, рассчитывают по формуле:

АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл х ФЧ

Подсчитывают количество полиморфноядерных лейкоцитов в 1 мкл крови, затем определяют количество фагоцитирующих лейкоцитов в 1 мкл крови.

Пример: общее количество лейкоцитов 1 мкл крови - 5000 с содержанием полиморфноядерных лейкоцитов - 60%

ПФ - 80%

ФЧ - 5

а) общее число лейкоцитов 5000 - 100%

полиморфноядерных лейкоцитов Х - 60 %

полиморфноядерных лейкоцитов = 3000

б) полиморфноядерных лейкоцитов 3000 - 100%

фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов Х - 80%

фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов = 2400

в) АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл крови х ФЧ

АФП=2400х5=1200

Приготовление реактивов (см. сноски *(7) и *(8) на предыдущей странице).

2.3.4. Определение численности Т-клеток, зрелых Т-клеток, Т-супрессоров, Т-хелперов, В-клеток, киллеров методом непрямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами.

Для определения субнопуляций Т-клеток у человека можно использовать метод розеткообразования и метод иммунофлюоресценции с моноклональными антителами. Последний является более точным.

Принцип метода основан на том, что антилимфоцитарпые мышиные моноклональные антитела присоединяются к соответствующим антигенным маркерам поверхности лимфоцита, а участки их фиксации выявляются при помощи антител к lg мыши, меченых ФИТЦ. Количество клеток, на поверхности которых обнаруживается свечение, характеризует численность субпопуляций, против маркеров которой были получены соответствующие моноклональные антитела (МкА). Постановку реакции осуществляют согласно инструкции к набору моноклональных антител.